高速逆流色譜分離制備高純度牛蒡多酚及其抗氧化研究

伍智蔚， 董 露， 韓佳佳

（1.中國科學院沈陽應用生態研究所，遼寧 沈陽 110015；2.沈陽市食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110122）

牛蒡（Arctium Lappa L）又名：惡實、大力子、東洋參，原產于中國，可與人參媲美[1]。多酚，分布于植物的果實、莖、根和葉，且具有多種活性[2]，如清除自由基，延遲衰老，抑制脂質過氧化，抑制腫瘤和治療心血管疾病等[3]。Ferracane 等人[4]對牛蒡成分進行了大量的分析，發現牛蒡中含有非常豐富的多酚類物質。在食品行業，牛蒡多酚類物質可被用作一種天然抗氧化劑、天然抗菌劑和保健性功能因子，具有重要的應用價值[5]。一般情況下，酚類化合物可采用溶劑/水提取、超聲波提取法、酶法以及超臨界提取[6]。在酶法提取工藝中，目標組分容易發生變化，酶法提取的成本可能會提高[7]。超臨界萃取法不存有毒性的溶劑，這種方法必需有專門的設備，所以它需要巨額的資金支持[8]。溶劑萃取是提取多酚的最流行最普及的手段。典型的溶劑包括甲醇，丙酮，乙醇等，其中最常用溶劑為乙醇和水[9]。同時超聲波法通過空化效應，使細胞結構損壞，加快目標成分分離，從而縮小提取的時間，減弱高溫對有效成分的損壞[10]。在分離純化方面，高速逆流色譜（High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC）分離因其液-液分配色譜的獨特特點及簡便的溶劑體系，可應用于單個產物的精制以及天然產物的粗提物的提純[11]。本實驗利用乙醇提取和超聲波提取結合的方法，旋蒸濃縮后得到牛蒡多酚粗提物；結合高速逆流色譜分離純化技術，建立高純度牛蒡多酚的制備分方法，為牛蒡多酚的分離純化以及大量生產提供一些新的方法與研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1）主要儀器設備

本實驗使用的主要儀器設備有KQ-1000DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SY-2000型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠），SHZ-D 型循環水式多用真空泵（鞏義市科華儀器設備有限公司），T600 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），TEB300C 型高速逆流色譜儀（上海同田生物有限公司），ME104E 型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

2）主要試劑

牛蒡購于遼寧省沈陽市雨潤農產品批發市場，經中國科學院沈陽應用生態研究所植物分類專家鑒定為菊科牛蒡屬植物。乙醇、正丁醇、乙酸乙酯均為分析純，冰醋酸、甲醇為色譜純，購于國藥集團試劑有限公司；實驗室自制超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的預處理

牛蒡多酚的提取方法為有機溶劑乙醇提取和超聲波提取相結合。用電子天平準確稱取干燥的牛蒡粉100 g，放入以固液比1∶8 為標準，加入70%的乙醇溶液中。將其放入超聲波清洗儀中超聲40 min 后，過濾，濾液在60 ℃下水浴旋蒸12 min，然后將其用70 ℃的水浴蒸干殘留乙醇，將樣品置于培養皿中，靜置待用。

1.2.2 溶劑體系的制備

根據選擇的最佳溶劑體系的比例，在2000 mL 的容器中配置2000 mL 的溶劑體系。制備后，將其充分地震蕩；搖勻20 min 后，將其靜置12 h。靜置完成后，將兩相溶液分別放到2000 mL 的錐形瓶中，固定相是上相，流動相是下相，將它們超聲脫氣60 min，靜置一段時間。再用移液管分別移取10 mL 的上相和10 mL的下相于試管之中，向試管中加入500 mg 牛蒡提取物。將其超聲30 min，使樣品全部溶解在兩相溶劑中，靜置待用。

1.2.3 溶劑體系的選擇與優化

根據樣品的極性，選擇合適的溶劑體系。先從經典體系出發，配置多種溶液比例放于試管中，劇烈震蕩試管，將其放在超聲波清洗器里面超10 min，靜置。待兩相溶液達到平衡后，各取5 mL 上下相溶劑，放置在同一25 mL 試管中，向其試管加入一定量的樣品。將其放置在超聲清洗器里面超聲30 min，拿出、靜置1 h。待樣品在兩相間均勻地分配平衡后，取相同體積的上下相溶液，將其在砂芯過濾裝置（0.45 μm 尼龍濾膜）中過濾1 次。用高效液相色譜分別測定目標組分的上下相中的峰面積A 上和A 下。根據公式計算出分配系數K 值，根據分配系數是否在0.5 ～2.0 之間來初步判定溶劑體系是否合適。

1.2.4 高速逆流色譜分離條件優化

1）固定相保留率的測定

主機分離管路的體積在一定條件下是一定值。首先通過泵入固定相后，記錄總進入固定相的體積V入、固定相溢出的體積V溢出，計算分離管路的體積V總=V入-V溢出。然后，向主機管路中泵進入流動相后，得到流動相所推出上相（固定相）體積V出。最后根據保留率計算公式w=（V總-V出）/（V總-20）×100%計算出固定相保留率。HSCCC 固定相的保留率影響樣品分離的效果，當固定相的保留率大于等于40%時，樣品的分離效果較好。

2）流動相流速的優化

流速是影響HSCCC 分離效果的很重要因素，主要影響分離時間的長短和分離度，在分離過程中選擇合適的流動相流速很關鍵。研究1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min、2.5 mL/min、3.0 mL/min 這5 個流速，并在高速逆流色譜儀800 r/min 的轉速、25 ℃的溫度條件下進樣，以此來研究HSCCC 流速的變化對固定相保留率的影響。

3）轉速的優化

高速逆流色譜儀的轉速是影響固定相保留率的主要因素，高的轉速可以獲得更好的保留率。轉速過高會給分離管帶來很大壓力，從而使分離管受到損傷。我們研究700 r/min、750 r/min、800 r/min、850 r/min、900 r/min 5 個轉速條件。保持其他最佳條件不變，我們研究HSCCC 轉速的變化對固定相保留率的影響。

4）分離溫度的優化

HSCCC 溫度也會對固定相的保留時間產生影響。我們研究15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃這5 個溫度條件。保證其他最佳條件不變，我們研究溫度對高速逆流色譜儀固定相保留時間的影響。

1.2.5 高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）分析

按下列條件進行HPLC 分析：色譜柱是Diamonsil Plus C18 色譜柱，250×4.6 mm，5 μm；紫外檢測波長為280 nm；流動相為1%冰乙酸：甲醇=3：1；流速大小為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL。

1.2.6 各組分的抗氧化活性

以最佳提取純化工藝制備的3 個組分（I、II 和III）為研究對象，以維生素C（Vc）為空白對照，采用試劑盒測試法測定各組分DPPH 溶液和ABTS 自由基清除能力。

1.2.7 數據處理與分析

采用Excel 軟件進行數據統計分析，每組實驗設立3 個平行實驗，結果以平均值±標準差表示；利用Origin（版本2018）軟件進行畫圖和方差分析。

2 結果與討論

2.1 HSCCC 溶劑體系的選擇與優化

HSCCC 進行樣品分離的關鍵就是樣品在溶劑體系中具有合適的分配系數（目標物上相峰面積與下相峰面積比，K）。我們初步選定氯仿-甲醇-正丁醇-水和乙酸乙酯-正丁醇-水為兩相的溶液體系，不同溶劑體系的選擇與優化見表1。

表1 溶劑體系的選擇與優化

由表1 知，在經典溶劑體系氯仿-甲醇-正丁醇-水（4：3：0.2：2，v/v）中，其HPLC 譜圖的出峰在上相，下相只存在1 個峰，且峰面積較小，出峰慢，分配系數為1.98；隨著增加正丁醇和水的比例，減少甲醇的比例，多酚特征峰仍然出在上相，下相出峰少且出峰慢，且分配系數均大于2，故舍棄該溶劑體系。而在溶劑體系乙酸乙酯-正丁醇-水中，隨著乙酸乙酯和正丁醇比例的增加，分配系數逐漸增大，當乙酸乙酯：正丁醇：水=3：4：5 時，分配系數為0.93，特征峰比較圓滑，而其他溶劑比例的特征峰面積比較寬扁，因此，選擇溶劑體系乙酸乙酯：正丁醇：水=3：4：5 為最佳分離體系。

2.2 高速逆流色譜分離及條件優化

2.2.1 固定相保留率的測定

由表2 可知，主機分離管路的總進入固定相的體積V入為342 mL，固定相溢出的體積V溢出為50 mL，所以管路測定總體積V總=V入-V溢出=292 mL。而流動相所推出上相體積V出為120 mL，所以固定相保留率=×100%=63.2%，本文所采用溶劑體系的固定相保留率大于40%，滿足固定相保留率的要求。

表2 固定相保留率測定結果 單位：mL

2.2.2 流動相流速的影響

在高速逆流色譜儀轉速為800 r/min 的情況下，我們研究1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min、2.5 mL/min、3.0 mL/min 這5 個流速下固定相保留率的變化情況，并觀察待測物質中各組成成分的色譜分離情況，結果如圖1 所示。

圖1 不同流動相流速對固定相保留率的影響

圖1顯示，當流速大小小于2.0 mL/min 時，固定相的保留率都大于70%。較小的流速能夠得到比較好的保留率，但又會延長體系的平衡時間，從而對分離的效果產生影響。流速較大時會減少固定相保留率，對分離的效果造成改變。故本實驗流動相的流速選取2.0 mL/min，這樣既可以有很好的分離效果，同時也可以縮短分離時間。

2.2.3 轉速的影響

圖2 顯示，隨著轉速愈來愈大，固定相保留率也愈來愈大。提高轉速，螺旋管柱中兩相間的分配和分離頻率也會相應地增加。當轉速高到一定程度后，固定相會大量流失，從而減弱分離效果。結合轉速對分離柱和分離效果影響，本實驗選擇轉速為800 r/min，可以達到理想的分離能力。

圖2 不同轉速對固定相保留率的影響

2.2.4 分離溫度的影響

5 個溫度條件對固定相的保留率的影響結果如圖3 所示。

圖3 不同分離溫度對固定相保留率的影響

合適的分離溫度能夠提高固定相的保留率，繼而增強HSCCC 分離的效果；改善色譜峰的分離度、提高分配效率。因此，本實驗確定的分離溫度為25 ℃，可以達到理想的分離效果。

2.3 高速逆流色譜的分離效果

以2 mL/min 的流速、800 r/min 的轉速條件，采用HSCCC 對牛蒡提取物進行了分離，固定相的保留率為63.2%，分離時間為200 min，高速逆流色譜分離圖譜見圖4。

圖4 牛蒡提取物的HSCCC 分離結果

圖4顯示，接取有特征吸收峰17～22min、32～50min、78～85 min 和110～128 min 時間段的分離液樣品，其中17～22 min 為溶劑特征峰，其余分離液分別記為組分I、組分II 和組分III。

2.4 HSCCC 峰成分及純度測定

應用HPLC 法對制備得到的3 組樣品進行純度分析。在3 個分離組分中主要單一成分對應峰的保留時間分別為3.54 min、7.76 min 和10.17 min。采用HPLC峰面積歸一化法，計算得到3 個單一成分的峰面積百分比分別為80.5%、82.7%和85.6%。利用加標回收法測定各組分定性推斷，3 個單一成分分別為綠原酸、咖啡酸、對香豆酸。

2.5 各組分的抗氧化活性分析

如圖5 所示，圖（a）和圖（b）分別為各組分DPPH和ABTS 自由基去除率分析結果。隨著Vc 溶液和各組分濃度的增加，DPPH 和ABTS 自由基的去除率逐漸增大。同一濃度下，各組分的DPPH 和ABTS 自由基去除能力均比維生素C 高，說明各組分均具有較強的抗氧化能力；各組分按照DPPH 和ABTS 自由基去除率由大至小分別為：組分I（綠原酸）、組分II（咖啡酸）、組分III（對香豆酸）。

圖5 各組分DPPH 和ABTS 去除率分析結果

在高速逆流色譜分離中，以最佳條件下提取出的牛蒡粗多酚為原料，通過高效液相色譜法測定目標組分在兩相間分配系數K 值，從而選擇最佳的溶劑體系。利用對不同的溶劑體系及同一溶劑體系中不同比例的比較，最終確定了最佳溶劑體系為：乙酸乙酯-正丁醇-水（3 ∶4 ∶5，v/v）。研究流動相在不同流速、轉速以及分離溫度對牛蒡提取物分離效果的影響，確定最優分離條件：流速2 mL/min、轉速800 r/min、溫度25 ℃，且各個單一成分的純度分別達到80.5%（綠原酸）、82.7%（咖啡酸）和85.6%（對香豆酸）。各組分按照DPPH 和ABTS 自由基去除率由大至小分別為：組分I（綠原酸）、組分II（咖啡酸）、組分III（對香豆酸）。