泥鰍尾部神經分泌系統的形態和顯微結構觀察

彭 巧， 王嘉敏， 譚 娟

（1.懷化學院，湖南 懷化 418008； 2.湖南農業大學，湖南 長沙 410125；3.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007）

魚類的尾部神經分泌系統（Caudal Neurosecretory System，CNSS）為魚類所特有，是一類主要存在于魚類脊髓末端的特殊的神經內分泌調控系統[1]。自19 世紀初它被發現以來，許多學者對不同種類魚類的CNSS進行了形態解剖觀察，研究表明軟骨魚類CNSS 主要由尾部神經分泌細胞（Dahlgren 細胞）及其軸突組成，在脊髓外部沒有觀察到明顯膨大結構[1，2]，硬骨魚類CNSS 主要由3 部分組成，包括行使神經分泌功能的Dahlgren 細胞，Dahlgren 細胞向尾端發出的富含神經末梢的軸突和向腹面膨大的神經毛細血管器官（尾垂體）[1-3]。不同魚類Dahlgren 細胞類型、數量、分布位置以及尾垂體的形態、數量等均有種間差異[1]。研究表明CNSS 可能參與斑馬魚（DanioRerio）、牙鲆（Paralichthys Olivaceus）等多種魚類的繁殖調控、滲透壓調節、應激、免疫等[3-5]。陳恒等[6]發現鯽（Carassius Auratus）的Dahlgren 細胞的酶細胞計量學、形態計量學以及糖類、脂類和蛋白質含量計量學的季節變化均與卵巢發育呈現平行關系。江鵬鑫等[5]利用電生理技術進一步發現促卵泡激素（Follicle-stimulating Hormone，FSH）能促進牙鲆Dahlgren 細胞放電頻率，同時誘導部分細胞靜止型放電轉向爆發型放電，本次實驗結果證明了FSH能夠調控CNSS，為進一步解析CNSS 在生殖和季節適應中的作用奠定基礎。因此，魚類CNSS 的結構和功能研究有助于神經內分泌調控系統功能研究的解析。

泥鰍（Misgurnus Anguillicaudatus）又名青鰍，隸屬于鯉形目、鰍科、泥鰍屬，是一種重要的小型淡水經濟魚類，其味道鮮美，營養價值高，廣受人們喜愛。據《本草綱目》記載，鰍魚有“暖中益氣”的功效，其富含蛋白質和維生素，對心血管保護和身體免疫能力的增強等方面具有顯著優勢，具有較高的食用與藥用價值，被譽為“水中人參”[7]。目前，有關泥鰍的研究較多，主要集中在生長和營養方面，國內外尚未發現對泥鰍CNSS的相關報道[7]。我們通過對泥鰍成魚不同性腺發育時期的CNSS 的形態和顯微結構觀察，探討泥鰍CNSS的形態結構特點以及Dahlgren 細胞與性腺發育之間的關系，為泥鰍繁殖生物學和神經生理學提供基礎資料，也為魚類的神經內分泌調控系統研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

泥鰍來自湖南省懷化市中心市場出售的野生二倍體泥鰍。我們挑選身體健康無損的成體解剖，取出性腺發育不同時期的30 尾個體（體長13.93±0.91 cm）的尾部脊髓用于實驗，包括Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各6 尾（成體泥鰍性腺已發育，無Ⅰ期）和Ⅴ期12 尾。Ⅴ期的12 尾魚均為腹部明顯膨大個體，在胸鰭基部分別注射絨毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，HCG）和促黃體素釋放激素A3 催產，注射量分別為每尾20單位和每尾5 μg，人工輕輕擠壓能流卵的個體（V 期材料），其中6 尾馬上取材，另外6 尾人工排卵后繼續暫養12 h，此時性腺退化（Ⅵ期材料）。

1.2 實驗方法

1.2.1 CNSS 形態學觀察

本實驗首先選用健康狀況良好的泥鰍個體，MS-222 麻醉后進行常規生物學測量；然后從其生殖孔處剪斷，對應于倒數第14 節脊椎骨，去掉兩側肌肉，剝離脊椎骨兩側椎弓，直至暴露出完整脊髓；最后借助Nikon 體視顯微鏡觀察并記錄CNSS的位置、外部形態。

1.2.2 CNSS 組織學的顯微觀察

不同個體的CNSS 與前段相連的脊髓神經一同用Bouin's 液固定，用常規石蠟包埋，Leica 2210 連續切片，厚度為6 μm，H.E.染色，中性樹膠封片，OLYMPUS BX51 攝影顯微鏡下觀察、拍照。

2 實驗結果

2.1 泥鰍CNSS 的外部形態結構

泥鰍脊髓外有1 層黑色脊膜包裹，內為乳白色，隨椎骨往后延伸包于錐弓內，椎骨逐漸變小，隨后尾椎骨與尾鰭骨相連向上延伸。剝離椎弓，完全暴露脊髓，我們能發現最后1 節尾椎骨處的脊髓末端有1 個明顯的向腹部突起的膨大結構，即泥鰍CNSS 的尾垂體。解剖發現泥鰍尾垂體呈2 種形態（如圖1）：一種尾垂體腹面呈葡萄狀，其表面有輕微的凹凸不平，背面外層可見明顯的黑色素細胞，往后延伸突然縮小呈絲線狀；另一種尾垂體腹面呈半橢圓形，表面光滑，顏色與前段脊髓相近，往后延伸逐漸變小。測量結果表明泥鰍成魚尾垂體體積較小，長度為0.88±0.13 mm，寬度為0.39±9.00×10-2mm，高為0.22±7.00×10-2mm。

圖1 泥鰍尾部神經分泌系統尾垂體的外部形態結構

2.2 泥鰍CNSS 的顯微結構

當性腺處于Ⅴ期時，通過對脊髓連續切片發現，脊髓外包有1 層黑色的脊膜，灰質、白質分界明顯，灰質呈典型的蝶形分布，中間有中央管，中央管壁由室管膜細胞緊密排列而成，白質由神經膠質細胞和神經纖維組成。從倒數第2 節脊椎骨對應的脊髓開始，白質、灰質界限模糊，逐漸出現細胞胞體較大、染色較深的神經分泌細胞，即Dahlgren 細胞（圖2A）。Dahlgren細胞軸突富含神經末梢，往后及腹面延伸，成束進入尾垂體。由于Dahlgren 細胞的增加和尾垂體膨大，脊髓中央管的位置由脊髓中央逐漸向背部靠近，從倒數第2 節脊椎骨開始，脊髓橫切面往后逐漸縮小，到尾垂體開始膨大處達到最小（圖2B），由于尾垂體的膨大，橫切面又逐漸增大（圖2C），但中央管逐漸縮小，室管膜細胞數量減少（圖2D），同時可見尾垂體內Dahlgren細胞胞體呈不規則多邊形，胞體邊界清晰，細胞豐盈，充滿分泌物，沒有看到明顯細胞核，周圍分布有大量神經膠質細胞，呈橢圓形，細胞核明顯但體積較小，還可見呈長管狀豐富的毛細血管和近似圓形的紅細胞分布（圖2E）；隨著脊髓往后延伸，尾垂體體積減小，橫切面面積縮小（圖2F），最終，中央管消失（圖2G），室管膜細胞消失，僅剩少量神經纖維（圖2H）。

圖2 泥鰍的CNSS 連續切片后不同位置的顯微結構

2.3 泥鰍CNSS 與繁殖之間的關系

比較泥鰍成魚不同性腺發育時期的CNSS（圖3），結果表明性腺發育為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期時，光學顯微鏡下沒有觀察到明顯差異，但在性腺發育成熟到Ⅴ期時，脊髓部分和尾垂體部分界限明顯，Dahlgren 細胞胞體較大，染色較深，尾垂體內毛細血管充盈，可見豐富的紅細胞。同時，神經膠質細胞的細胞核染色明顯，數目增加；隨著卵粒排空后，性腺萎縮，即性腺發育到Ⅵ期時，顯微結構表明脊髓部分與尾垂體界限仍然很清晰，但均出現了大量空泡化細胞，神經膠質細胞的細胞核數目也明顯減少。

圖3 泥鰍性腺處于不同時期所對應的CNSS 顯微結構

3 討論與結論

魚類CNSS 最早報道是1914 年，科學家在軟骨魚（鰩科）中發現脊髓末端有一些特殊的大神經元，即后來命名的Dahlgren 細胞。Dahlgren 細胞分布的位置、大小因魚種不同而有差異。南方鲇（Silurus Meridionalis）的Dahlgren 細胞集中于最后3 個脊椎骨所對應脊髓的背面灰質內[7]，而北梭魚（Albua Vnlpes）、歐洲川鰈（Platichthys Flesus）、牙鲆等海水硬骨魚類的Dahlgren細胞主要分布在最后6—9 個脊椎骨對應的脊髓[1，2，5]，板鰓亞綱等海水軟骨魚類個別種類的Dahlgren 細胞在脊髓中的分布范圍很廣[1]。本研究發現泥鰍最后2節脊椎骨對應的脊髓中Dahlgren 細胞豐富且胞體較大，胞核較小。Dahlgren 細胞是CNSS 的主要功能細胞，分布位置、數量均存在種間差異，可能是環境適應性的結果[8，9]。泥鰍與南方鲇都屬于淡水硬骨魚類，而北梭魚、歐洲川鰈、牙鲆等為海水魚類，已有研究表明Dahlgren 細胞可能與滲透壓調節有關[1]，但其數量是否與滲透壓調節能有關還有待研究。

尾垂體是由Dahlgren 細胞發出的富含神經末梢的軸突與毛細血管接觸形成的特殊神經血管區，是魚類特有的內分泌腺，可直接將活性物質釋放到毛細血管，然后由毛細血管匯總入尾靜脈中，通過血液循環輸送到目標區域行使相應功能[1]。尾垂體是CNSS 的功能發揮區域，不同魚類大小不同，Kriebel R M等[10]報道北美大眼鯡（Pomolobus Aestivalis）的尾垂體的平均大小長為1 mm，寬為1.3 mm，高為0.5 mm；朱洪文等[11]則報道鯽魚尾垂體長約2.5 mm，寬約1 mm，有關尾垂體大小是否與個體大小有關暫無定論，但已有研究表明南方鲇尾垂體體積從3 月齡到7 月齡魚隨個體增加而逐漸增大[8]，泥鰍屬于小型經濟魚類，其尾垂體體積較小可能與其個體大小有一定關系。

H.E 染色是經典的細胞染色方法，蘇木精為堿性染液，主要與呈酸性帶負電荷的染色質結合成藍色；伊紅為酸性染料，與蛋白質的氨基正電荷的陽離子結合使胞漿染成不同程度的紅色，染色深淺與結合的離子數量有一定關系。魚類CNSS 主要的分泌產物是神經肽，包括Dahlgren 細胞分泌的尾緊張素Urotensin Ⅰ（UⅠ）和Urotensin Ⅱ（UⅡ），還有促腎上腺皮質激素釋放激素[12-14]。這些激素可能通過生理軸調節皮質醇的分泌[15]，從而參與適應性生理學的各個方面，包括滲透調節、繁殖、營養與壓力等有關的反應。Sharma等[16]研究麗塔鲇（Rita）的CNSS 中發現，繁殖期間，Dahlgren 細胞分泌中Herring 小體的分泌物消失，只剩下空腔，同時毛細血管體積擴大，并推測Herring 小體的內含物排入微血管中。陳恒、朱洪文等發現鯽魚Dahlgren 細胞胞體蛋白質含量變化有顯著的季節性差異，且隨著季節的變化，鯽魚CNSS 的分泌物具有釋放、恢復、累積和充滿的周期性變化[14，17]。本實驗結果與鯽魚、南方鲇等結果類似，隨著性腺發育成熟至Ⅴ期，泥鰍CNSS 中Dahlgren 細胞體積增大，染色較深，分泌物較多，而產完卵后即性腺發育到Ⅵ期時CNSS 中Dahlgren 細胞空泡化嚴重，膠質細胞核萎縮減少，這表明泥鰍產卵時期CNSS 分泌大量堿性分泌物，并通過毛細血管進入血液循環。本次研究結果為CNSS 參與魚類繁殖調控提供了一些組織學證據。