中華倒刺鲃MYD88 基因的克隆及表達載體構(gòu)建

李 俊

（懷化學(xué)院，湖南 懷化 418008）

魚類作為低等級的脊椎動物，其獲得性免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，當身體受到外部病原體的干擾時，其主要通過先天性免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用[1]。而先天性免疫系統(tǒng)通過各種模式識別受體（Pattern Recognition Receptors，PRRs）來識別侵入體內(nèi)的病原的相關(guān)分子模式，這為機體提供了直接、快速的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在感染早期發(fā)揮重要作用[2-3]。髓樣分化因子88（Myeloid-Differentiation Primary Response Protein 88，MYD88）是Toll 樣受體（Toll-like Receptors，TLRs）的關(guān)鍵接頭分子，TLRs 是生物體內(nèi)重要的PRRs，其向下游傳導(dǎo)信號有2 種不同的途徑，一種是MYD88 依賴性傳導(dǎo)途徑，另一種是MYD88 非依賴性傳導(dǎo)途徑[4-5]。MYD88介導(dǎo)幾乎所有TLR 參與的信號傳導(dǎo)[6]途徑（TLR3 參與的除外），并且MYD88 是這些信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵銜接蛋白[6-7]。

MYD88 本質(zhì)為胞質(zhì)可溶性蛋白質(zhì)，其相對分子量約為35 kDa，由C 端Toll/白介素1 受體結(jié)構(gòu)域（Toll/IL-1R Domain，TIR）、中間區(qū)域和N 端死亡結(jié)構(gòu)域（Death Domain，DD）構(gòu)成[8-9]。MYD88首先通過其TIR結(jié)構(gòu)域與白介素1 受體（Interleukin-1 Receptor，IL-1R）/TLRs 相結(jié)合，并通過DD 募集白介素受體相關(guān)激酶（Interleukin-1 Receptor-Associated Kinases，IRAKs），募集到的IRAK 被磷酸化后，再與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子相互作用，使IκB 激酶復(fù)合物（Inhibitor ofKappa B Kinase，IKK）激活，從而導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)基因活化并轉(zhuǎn)錄，從而最終引起死亡及細胞凋亡相關(guān)信號的傳導(dǎo)和促進炎癥反應(yīng)的相關(guān)基因的表達[10-12]。研究表明，MYD88 不僅在信號通路中起核心作用，還參與炎癥和自身免疫性疾病[13]、神經(jīng)性疾病[14]及代謝類疾病[15]等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[16]。近年來MYD88基因已從多個物種如鴨嘴海豆芽、白尾雷鳥、家鼠等中分離鑒定出來，在魚類中，已有文獻報道斑馬魚（Danio Rerio）[17]、鯉魚（Cyprinus Carpio）[18]、大黃魚（Pseudosciaena Crocea）[19]、牙鲆（Paralichthys Olivaceus）[20]、大西洋鮭（Salmo Salar）[21]等的MYD88 基因被克隆鑒定，并且證實了其在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用。

中華倒刺鲃（Spinibarbus Sinensis）俗稱青波、青板、巖鯽等，屬鯉形目（Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），鲃亞科（Barbinae），倒刺鲃屬（Spinib arbusoshima）[22]。中華倒刺鲃為長江中上游珍稀特有魚類，具有耐寒、抗病能力強、易飼養(yǎng)和開發(fā)利用價值高的特點。中華倒刺鲃的養(yǎng)殖規(guī)?，F(xiàn)已顯著擴大，但其養(yǎng)殖病害的發(fā)生十分頻繁，常見的疾病有腸胃炎、肌肉潰爛病、氣泡病、水霉病、卵甲藻病、寄生性疾病等[23-24]。因此研究中華倒刺鲃的免疫基因及免疫調(diào)控機理對整個中華倒刺鲃養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展顯得尤為重要，而目前中華倒刺鲃MYD88 基因的相關(guān)研究尚未有報道。本研究利用分子生物學(xué)實驗技術(shù)，開展了中華倒刺鲃MYD88 基因的克隆和表達載體的構(gòu)建，為后續(xù)進一步探究MYD88 在中華倒刺鲃先天性免疫系統(tǒng)中的作用提供了一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的材料有中華倒刺鲃、大腸桿菌DH5α菌株。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆

本研究根據(jù)課題組已有的中華倒刺鲃腎臟全長轉(zhuǎn)錄組序列信息（其中MYD88 基因編號為T23130），設(shè)計了引物T23130-F 和T23130-R（見表1），并構(gòu)建克隆載體。本實驗首先以中華倒刺鲃腎臟cDNA 為模板，利用聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)擴增了中華倒刺鲃MYD88 基因序列。隨后，實驗員通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測PCR 產(chǎn)物，切割下合適大小的條帶，利用DNA 凝膠回收試劑盒（碧云天，中國）進行回收，回收后再進行加A 尾的操作。

表1 基因擴增的引物序列

實驗員首先利用DNA 純化試劑盒（碧云天，中國）對上述加A 尾產(chǎn)物進行純化，隨后將其連接到pMD-18T（TaKaRa，日本）載體上，最后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。第2 天，實驗員蘸取少量陽性克隆菌進行菌落PCR檢測并通過瓊脂糖凝膠電泳進行初步驗證，隨后挑選合格的陽性單克隆菌進行擴大培養(yǎng)。最后，實驗員利用質(zhì)粒小量抽提試劑盒（碧云天，中國）對培養(yǎng)過夜的菌液進行質(zhì)粒提取，并以提取的質(zhì)粒為模板進行PCR檢測，檢驗合格后，再將質(zhì)粒送往擎科生物公司測序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

本研究利用Jellyfish 軟件對所獲得的中華倒刺鲃的MYD88 蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列（Coding Sequence，CDS）進行翻譯，并使用Expasy 一級結(jié)構(gòu)分析數(shù)據(jù)庫（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測MYD88 蛋白質(zhì)的分子量及等電點，再通過美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中的BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）來模塊預(yù)測MYD88 蛋白結(jié)構(gòu)域。本研究通過NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載其他物種的MYD88蛋白質(zhì)序列來進行結(jié)構(gòu)域比較，并通過MEGA.X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 表達載體構(gòu)建

本研究利用NCBI 網(wǎng)站的BLAST X 模塊對測序獲得的MYD88 基因序列進行分析，找到其開放閱讀框，再通過Primer Premier 5 軟件設(shè)計并構(gòu)建表達載體的引物T23130（MYD88）-3-F（3 x FLAG）和T23130（MYD88）-3-R（3 x FLAG）（見表1）。本研究取已測序合格的克隆載體作為模板，利用表達載體構(gòu)建引物進行PCR 擴增并回收目的DNA；之后利用限制性核酸內(nèi)切酶對PCR 產(chǎn)物和pcDNA3.1-MCS-3xflag 載體分別進行酶切。本研究使用的限制性核酸內(nèi)切酶為QuickCut BamH Ⅰ（TaKaRa，日本）和QuickCut Hind Ⅲ（TaKaRa，日本）。酶切1 h 后實驗員對樣品進行酶切產(chǎn)物純化實驗以及連接實驗。實驗員隨后利用T4 DNA Ligase（碧云天，中國）將酶切純化后的PCR 產(chǎn)物和載體過夜連接。連接完成后再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，并對過夜培養(yǎng)后的單菌落進行編號，蘸取少量單菌落進行菌落PCR 實驗，之后挑選合格的陽性克隆菌進行擴大培養(yǎng)。提取到合格的重組質(zhì)粒后，實驗員對質(zhì)粒進行酶切檢測，然后將其送往擎科生物公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 MYD88 克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1 MYD88 克隆

利用所設(shè)計的克隆引物T23130-F（MYD88）和T23130-R（MYD88）進行PCR 擴增獲得1300 bp 左右的DNA 片段，將得到的MYD88 目的片段連接到pMD-18T克隆載體并進行菌落PCR 鑒定。測序結(jié)果顯示擴增片段與MYD88 基因序列一致，這說明獲得MYD88基因已被成功克隆。中華倒刺鲃MYD88 基因序列已提交GenBank，編號為OQ079619。

2.1.2 MYD88 序列和進化分析

MYD88 基因編碼含有284 個氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子量為32 kDa，等電點（Isoelectric point，PI）為5.52，分子式為C1471H2315N383O430S20，負電荷殘基數(shù)為42，正電荷殘基數(shù)為39，不穩(wěn)定系數(shù)為36.98，總平均疏水性為-0.2485，推測MYD88 蛋白是一個穩(wěn)定的親水蛋白。圖1 為采用NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 進行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測的結(jié)果，其中MYD88 氨基酸序列第21—98位為DD 結(jié)構(gòu)域，第148—284 位為TIR 結(jié)構(gòu)域。

圖1 MYD88 的核苷酸和氨基酸序列

通過比較中華倒刺鲃的MYD88 與人（Homo Sapiens）、黑猩猩（Pan Troglodytes）、家鼠（Mus Musculus）、挪威鼠（Rattus Norvegicus）、原雞（Gallus gallus）、白尾雷鳥（Lagopus Leucura）、虎斑響尾蛇（Crotalus Tigris）、束帶蛇（Thamnophis Elegans）、雙條吻蚓（Rhinatrema Bivittatum）、熱帶爪蟾（Xenopus Tropicalis）、斑馬魚（DanioRerio）、鱖（Siniperca Chuatsi）等已報道的MYD88蛋白序列，我們發(fā)現(xiàn)人的MYD88 只編碼DD 結(jié)構(gòu)域，白尾雷鳥的MYD88 只編碼TIR 結(jié)構(gòu)域，其他物種MYD88 均編碼DD 和TIR 結(jié)構(gòu)域。圖2 顯示，斑馬魚MYD88 編碼DD 和TIR 結(jié)構(gòu)域的序列位置與中華倒刺鲃MYD88 一致。

圖2 中華倒刺鲃MYD88 與其他物種MYD88 的結(jié)構(gòu)域比較

本研究使用MEGA.X 軟件，采用Neighbor-Joinning法對中華倒刺鲃和斑馬魚（Danio Rerio）、斑點叉尾鮰（Ictalurus Punctatus）、紋霸鹟（Empidonax Traillii）、恒河猴（Macaca Mulatta）等24 個物種的MYD88 氨基酸序列以Bootstrap 重復(fù)1000 次的計算方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。圖3 顯示魚類MYD88 聚為一支，中華倒刺鲃與斑馬魚的親緣關(guān)系最近，它們都屬于鯉形目，其次是斑點叉尾鮰。

圖3 MYD88 系統(tǒng)進化樹

2.2 表達載體構(gòu)建

圖4 顯示了以測序驗證合格的克隆載體為模板，并利用PCR 技術(shù)對MYD88 基因編碼區(qū)部分進行擴增來獲得的大小為850 bp 左右的條帶。

圖4 MYD88 編碼區(qū)的PCR 擴增

本實驗首先用QuickCut BamH Ⅰ和QuickCut Hind Ⅲ2 種限制性核酸內(nèi)切酶對純化后的PCR 產(chǎn)物以及表達載體pcDNA3.1-MCS-3xflag 進行酶切實驗，酶切純化后再進行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進大腸桿菌，最后在第2 天進行菌落PCR 檢測。圖5 顯示通過菌落PCR 獲得了8 個陽性單克隆，我們選擇其中3 個菌落進行擴大培養(yǎng)及保種。本實驗提取5 號陽性菌的質(zhì)粒并通過雙酶切實驗驗證，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示質(zhì)粒中被切出大小約為850 bp 的目的基因條帶，這證明本實驗成功構(gòu)建了MYD88 基因表達載體。

圖5 MYD88 表達載體經(jīng)BamH Ⅰ與Hind Ⅲ雙酶切檢測

將該質(zhì)粒送擎科生物公司測序驗證發(fā)現(xiàn)，pcDNA 3.1-MYD88-3xflag 表達載體構(gòu)建成功。

本文成功克隆了中華倒刺鲃MYD88 完整cDNA序列，全長約為1303 bp，其中開放閱讀框855 bp，編碼284 個氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MYD88 蛋白存在DD 和TIR 結(jié)構(gòu)域。根據(jù)蛋白質(zhì)序列基本性質(zhì)分析可推測MYD88 蛋白是一個穩(wěn)定的親水蛋白。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示：魚類的MYD88 單獨聚成一支。中華倒刺鲃與同屬鯉形目的斑馬魚聚類在一起，繼而與其他魚類聚成一支。本結(jié)果與其各物種間的系統(tǒng)進化關(guān)系是一致的。

本文成功構(gòu)建了MYD88 基因表達載體pcDNA 3.1-MYD88-3xflag，但并沒有深入研究MYD88 的功能。TLR 信號通路在魚類先天性免疫過程中都發(fā)揮著重要作用，而MYD88 作為TLR 信號通路中一個重要的接頭蛋白，其在中華倒刺鲃先天性免疫應(yīng)答過程中可能起著更為關(guān)鍵的作用[25]。本實驗為后續(xù)進一步研究中華倒刺鲃MYD88 基因的功能以及免疫調(diào)控機理奠定了基礎(chǔ)，希望能夠為魚類疾病的預(yù)防提供新思路。