高效液相色譜法測定椰汁中脫氫乙酸含量的不確定度評定

王攀峰

（山西省檢驗檢測中心（山西省標準計量技術研究院），山西太原 030012）

脫氫乙酸及其鈉鹽是聯合國糧食及農業組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）與世界衛生組織（World Health Organization，WHO）公認的一種低毒、高效、廣譜的食品防腐劑，其對霉菌、酵母菌與細菌有著較強的抑制作用，在面包糕點、腌制蔬菜、果汁飲料及熟肉制品等食品加工與貯存過程中廣泛使用[1]。然而，部分食品生產企業超限量或超范圍使用脫氫乙酸，消費者過量攝入后，會對其肝臟或腎臟造成影響，甚至存在致癌風險[2]。《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）[3]規定果蔬汁（漿）中脫氫乙酸及其鈉鹽的最大使用量為0.3 g·kg-1。為加強果汁飲料的日常監管，準確測定其中脫氫乙酸及其鈉鹽的含量，避免在測定結果接近臨界值時出現誤判情況，本研究依據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[4]中規定的方法程序，對《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）[5]中高效液相色譜法測定椰汁中脫氫乙酸含量的不確定度進行評定，分析影響測定結果的關鍵因素，以便提高檢測結果的準確性，也為檢驗檢測機構在評估其他檢驗項目測量不確定方面提供理論基礎與科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椰汁，購自某超市；甲醇中脫氫乙酸標準溶液（濃度為1 000 μg·mL-1），壇墨質檢科技股份有限公司；甲醇（色譜純），德國默克公司；甲酸（分析純），無錫市亞泰聯合化工有限公司；硫酸鋅、氫氧化鈉（均為分析純），江蘇省亞泰集團化工有限公司。

1.2 儀器與設備

U3000高效液相色譜儀（DAD檢測器），美國賽默飛世爾公司；AL104電子天平（精度0.000 1 g），瑞士梅特勒-托利多公司；JL-SPE-12B固相萃取裝置，上海靳瀾儀器公司；C18固相萃取柱（500 mg/6 mL），常德比克曼生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

參照《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）中第二法 液相色譜法進行椰汁中脫氫乙酸含量的測定。

1.3.1 標準溶液配制

（1）標準儲備液。準確吸取1.0 mL甲醇中脫氫乙酸標準溶液（1 000 μg·mL-1）置于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成濃度為1 00 μg·mL-1的脫氫乙酸標準儲備液。

（2）標準工作液。準確吸取1.0 mL脫氫乙酸標準儲備液用超純水稀釋成10 μg·mL-1的標準中間液。分別吸取0.10 mL、0.40 mL脫氫乙酸標準中間液，0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL和1.0 mL脫氫乙酸標準儲備液于6個10 mL容量瓶中，用超純水定容，配制成濃度為0.1 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的系列標準工作液。

1.3.2 試樣制備提取

準確稱取2.5 g（精確至0.000 1 g）椰汁試樣置于25 mL離心管中，加入10 mL超純水、5 mL硫酸鋅溶液（120 g·L-1），用氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）調節pH值至7.5，轉移至25 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，搖勻，置于離心管中，4 000 r·min-1離心10 min。移取20 mL上清液于25 mL容量瓶中，用10%的甲酸溶液調節pH值至5，用超純水定容至刻度。將C18固相萃取柱依次用5 mL甲醇、10 mL水活化，取5 mL試液過柱，再用5 mL水淋洗，2 mL 70%的甲醇溶液洗脫，收集2 mL洗脫液，渦旋混勻，過0.45 μm有機濾膜后上機測試。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：艾杰爾XBP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：10%甲醇+90% 0.02 mol·L-1乙酸銨（體積比）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；DAD檢測器：波長293 nm。

1.4 數學模型建立

建立的數學模型見公式（1）。

式中：X為椰汁試樣中脫氫乙酸含量，g·kg-1；m為椰汁試樣稱取質量，g；V為試液總體積，mL；c1為待測試液中脫氫乙酸的濃度，μg·mL-1；c0為空白試液中脫氫乙酸的濃度，μg·mL-1；f為過固相萃取柱的換算系數，f=0.5。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源

從測定過程與數學模型來看，本試驗中測量不確定度主要來源于試樣稱量、試樣制備提取、標準溶液配制、標準曲線擬合及測量重復性等過程。

2.2 測量不確定度分量評定

2.2.1 試樣稱量過程引入的不確定度分量urel(m)

使用AL104電子天平稱取2.500 0 g椰汁試樣，由檢定證書獲得示值誤差為±0.000 5 g，偏載誤差為±0.000 5 g，重復性誤差為±0.001 g，按正態分布考慮，則試樣稱量過程引入的不確定度為

2.2.2 試樣制備提取引入的不確定度分量urel(V)

由數學模型可知，試樣制備提取引入的不確定度來自試液定容的總體積，定容過程使用25 mL單標線容量瓶（A級），根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）[6]獲得容量允差為±0.03 mL，20 ℃時容量校正引入的不確定度按矩形分布，依據公式（2）計算；實驗溫差為±3 ℃，水膨脹系數為2.10×10-4℃-1，由實驗室溫差產生的不確定度按矩形分布，依據公式（3）計算。由玻璃量器引入的相對不確定度依據公式（4）計算，求得urel(V)=0.000 78。

式中：ΔS表示玻璃量器的容量允差；V表示玻璃量器移取或定容試液的體積，mL。

2.2.3 標準溶液配制引入的不確定度分量urel(c)

（1）標準溶液賦值。甲醇中脫氫乙酸標準溶液編號為91351A，批號為A22050324，標準溶液證書顯示相對擴展不確定度為U=kurel(cb)=2%（k=2），則urel(cb)=2%/2=0.010 0。

（2）標準儲備液配制。吸取1.0 mL標準溶液使用的1 mL分度吸量管（A級）的容量允差為±0.008 mL，定容使用的10 mL單標線容量瓶（A級）的容量允差為±0.020 mL，依據公式（2）、（3）、（4）求得urel(V1)=0.004 63，urel(V10)=0.001 21，則該過程引入的相對不確定度為

（3）標準工作液配制。標準中間液配制與儲備液配制過程所用玻璃量器相同，引入的相對不確定度urel(c2)=urel(c1)=0.004 79。標準工作液配制時6次使用1 mL分度吸量管（A級），6次使用10 mL單標線容量瓶（A級），該過程引入的相對不確定度為

由此，標準溶液配制引入的相對標準不確定度為

2.2.4 標準曲線擬合引入的不確定度分量urel(q)

將1.3.1中配制的系列標準工作液上機測試，測得峰面積分別為0.025 481、0.131 380、0.334 300、0.818 980、2.294 000和4.674 600。以脫氫乙酸標準系列濃度為橫坐標，相應測得峰面積為縱坐標，擬合標準工作曲線，線性方程為Y=0.474 7c-0.084 0，其中b=0.474 7，a=-0.084 0。標準曲線擬合引入的標準不確定度根據以下公式計算。

式中：n為標準工作液測試次數，n=6；p為椰汁試樣測試次數，p=6；測得椰汁試樣平均值為0.049 4 g·kg-1，代入數學模型中求得c=9.88 μg·mL-1，標準工作液各濃度點的平均值=3.083 3 μg·mL-1。

計算得sR=0.049 96，u(q)=0.103 39 μg·mL-1，則

2.2.5 測量重復性引入的不確定度分量urel(s)

將椰汁試樣在期間精密度測量條件下測試6次，結果分別為0.049 5 g·kg-1、0.048 8 g·kg-1、0.049 8 g·kg-1、0.049 1 g·kg-1、0.049 7 g·kg-1和0.049 6 g·kg-1，標準偏差s=0.000 387，則標準不確定度為

相對標準不確定度為

2.3 合成與擴展不確定度

將各個相對不確定度分量進行合成得

則標準合成不確定度為u=0.049 4×0.020 1=0.000 99 g·kg-1。取包含因子k=2，置信概率p=95%，則測量擴展不確定度U=ku=0.002 0 g·kg-1。因此，測量不確定度結果報告為（0.049 4±0.002 0）g·kg-1（k=2，p=95%）。

3 結論

通過分析評定高效液相色譜法測定椰汁中脫氫乙酸含量的測量不確定度，發現標準溶液配制與標準曲線擬合過程對測量結果影響較大，其次為測量重復性、試樣制備提取體積及試樣稱量過程。因此，檢驗檢測機構相關部門要重視玻璃量器與大型儀器的計量檢定工作，并督促實驗室做好標準溶液與儀器設備的期間核查工作。此外，還應重視實驗人員的職業水平培訓，提升其實驗操作水平技能與對大型儀器設備的維護能力，盡可能地降低測量不確定度，提高檢測結果的準確性。