低分子肝素對內毒素誘導肝細胞凋亡及炎癥的影響

潘毅,陳軍喜,夏至輝,閆智杰（南昌大學第四附屬醫院,江西 南昌 330002）

膿毒癥（Pyohemia）是一種由全身感染引起的危及生命的疾病，其伴隨著嚴重的炎癥反應以及免疫反應失調等特征，導致器官功能衰竭[1]。肝臟是調節宿主代謝以及免疫防御的主要器官，而肝衰竭和功能障礙是膿毒癥的并發癥之一，也是死亡率較高的原因之一[2]。低分子肝素（Low Molecular Weight Heparin，LMWH）是臨床抗凝的常用藥物，在臨床防治膿毒癥肝損傷上取得了良好的療效。唐勇[3]等人采用Meta分析研究探索了低分子肝素對中國人群膿毒癥療效，結果顯示LMWH治療膿毒癥可以降低病死率和APACHEⅡ評分。本課題組既往采用經典的大鼠盲腸結扎穿孔膿毒癥模型證實LMWH能顯著降低膿毒癥大鼠肝的損害、抑制炎癥因子的釋放[4]。本研究擬進一步采用LPS誘導體外培養肝細胞損傷及炎癥模型，探索LMWH防治膿毒癥肝損傷的機制，為LMWH治療膿毒癥肝損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 LMWH購自河北常山生化藥業有限公司（批號：F402160906）；谷胱甘肽（GSH）購自碧云天生物技術有限公司（貨號：S0073）；TUNEL染色試劑盒購自美國羅氏生物（貨號：11684795910）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）Elisa試劑盒購自武漢博士德生物工程公司（貨號：EK0525、EK0410）；LPS購自美國Sigma公司（貨號：L2630）；MTS檢測試劑盒購自美國Promega公司（貨號：G3582）；乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物（貨號：C0016）；DMEM培養液、胎牛血清購自美國Gibco公司（貨號：10099133、11965092）；兔抗NF-κBp65、p-NF-κBp65、GAPDH抗體購自美國CST公司（貨號：8242、3033、5147）。

1.2 細胞培養及分組 Lo2人正常肝細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，用含10%FBS的DMEM培養基，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。將Lo2細胞分為以下幾組：對照組：給予等體積的溶劑；LPS組：加入20ng/mlLPS；LMWH低、中、高劑量組：分別給予100U/L、200U/L、400U/L的LMWH；GSH組給予20μMGSH處理24h。

1.3 MTS細胞活力檢測 按照4×103/孔，將Lo2細胞接種于96孔板，按實驗分組給予不同的處理。24h后，棄去培養液，加入新鮮的DMEM培養基（100μl）和MTS檢測液（10μl）孵育2h后，用酶標儀（美國伯騰公司，Epoch）檢測波長490nm處吸光度（OD值）。細胞活力=（干預組OD-空白孔OD）/（對照組OD-空白孔OD）×100%。每組設6個復孔，取其平均值。

1.4 TUNEL染色 TUNEL染色按試劑盒說明書進行操作。TUNEL用于標記凋亡細胞，陽性凋亡細胞呈綠色，DAPI用于標記細胞核，呈藍色。每孔隨機觀察5個200倍視野，分別計數細胞核總數（標記藍色熒光）和凋亡細胞數（標記綠色熒光）計算凋亡指數（Apoptosis Index%）。Apoptosis Index（%）=凋亡陽性細胞核數÷總計數的細胞核×100%。

1.5 Elisa檢測 將Lo2細胞接種于24孔板，按實驗分組給予不同的處理，每組6個副孔。24h后，收集細胞上清，根據Elisa試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6含量。

1.6 Western blot檢測 不同刺激處理Lo2細胞24小時后，PBS洗1次，加入適量的RIPA裂解液（碧云天生物）裂解，提取總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物）定量，樣品加入緩沖液，100℃、5min變性，總蛋白上樣量為10μg，用10%的SDS-PAGE電泳在蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司，Mini-PROTEANTetra）分離，半干電轉法將蛋白質轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1h后，分別用相應的1抗（1∶1000）在4℃過夜，TBST洗膜3次后用2抗（CST公司，1∶5000稀釋）在室溫孵1h，TBST洗膜3次后用ECL化學發光法檢測蛋白條帶，用GAPDH蛋白條帶作為內參，計算目的條帶和內參條帶的灰度值之比。

1.7 統計分析 采用SPSS16.0軟件進行統計分析。實驗數據以均數±標準差（MeanSD）表示，One-way ANOVA方差分析用于多重比較，方差齊性采用LSD進行兩兩比較，方差不齊性的采用Dunnetts T3進行兩兩比較，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LMWH對LPS誘導肝細胞損傷的影響MTS結果如圖1A所示，LPS處理Lo2細胞24h后，Lo2細胞的細胞活力顯著降低，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。LMWH與LPS共同處理Lo2細胞24h后，LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導的細胞活力降低（P均＜0.05）。LDH檢測結果如圖1B所示，LPS處理Lo2細胞24h后，Lo2細胞LDH釋放顯著升高，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），LMWH與LPS共同處理Lo2細胞24h后，LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導的LDH釋放增加（P均＜0.05）。GSH能顯著抑制LPS誘導的細胞活力降低和LDH釋放顯著升高，與LPS組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。GSH組的細胞活力、LDH含量與LMWH高劑量組比較，差異沒有統計學意義（P＞0.05）。

2.2 LMWH對LPS誘導肝細胞凋亡的影響 TUNEL染色結果如圖2所示，LPS處理Lo2細胞24h后，Lo2細胞的凋亡指數顯著升高，與對照組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）。LMWH與LPS共同處理Lo2細胞24h后，LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導的凋亡指數升高，與LPS組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）。GSH能顯著抑制LPS誘導的細胞凋亡，與LPS組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。GSH組的凋亡率與LMWH高劑量組比較，差異沒有統計學意義（P＞0.05）。

圖2 LMWH對LPS誘導肝細胞凋亡的影響。注：A：TUNEL凋亡染色圖像；B：凋亡指數（n=3）。與LPS組比較，*P＜0.05；與GSH組比較，#P＜0.05

2.3 LMWH對LPS誘導肝細胞炎癥的影響 TNF-α、IL-6結果如圖3所示，LPS處理Lo2細胞24h后，Lo2細胞的TNF-α、IL-6的含量顯著升高，與對照組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）。LMWH與LPS共同處理Lo2細胞24h后，LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導的TNF-α、IL-6含量升高，與LPS組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）。GSH能顯著抑制LPS誘導的TNF-α、IL-6升高，與LPS組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。GSH組的TNF-α、IL-6含量與LMWH高劑量組比較，差異沒有統計學意義（P＞0.05）。

圖3 LMWH對LPS誘導肝細胞炎癥的影響。注：A：TNF-α含量（n=6）；B：lL-6含量（n=6）。與LPS組比較，*P＜0.05；與GSH組比較，#P＜0.05

2.4 LMWH對LPS誘導NF-κB激活的影響 Western blot結果如圖4所示，LPS處理Lo2細胞24h后，Lo2細胞中p-p65的含量顯著升高，與對照組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）。LMWH與LPS共同處理Lo2細胞24h后，LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導的p-p65含量升高，與LPS組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）。GSH能顯著抑制LPS誘導的NF-κB激活，與LPS組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。GSH組的p-P65含量與LMWH高、中劑量組比較，差異沒有統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，膿毒癥導致肝功能障礙甚至肝功能衰竭[5]。LPS是膿毒癥引起肝損傷的重要機制，膿毒癥早期，腸黏膜通透性增高，腸道細菌或LPS通過門靜脈移位至肝臟，引起肝細胞的凋亡和炎癥[6]。目前，恢復肝功能已經成為降低膿毒癥死亡率的重要途徑[7-8]。LMWH由普通肝素經化學或酶學方法解聚而成，相對分子質量為45000D，是一種臨床上常用的抗凝藥物。目前已證實，LMWH能夠抑制膿毒癥患者炎性介質和氧自由基的釋放，抑制細胞黏附和激活、補體系統的激活，保護血管內皮細胞的連續性和完整性，從而改善膿毒癥患者微循環功能[9]。本研究針對LMWH對LPS誘導肝細胞凋亡的作用及機制進行探索。

本研究采用20ng/ml的LPS刺激肝細胞，制備LPS誘導Lo2肝細胞損傷模型，結果顯示LPS顯著降低肝細胞的細胞活性、增加LDH釋放，這提示LPS誘導了肝細胞的損傷，表明了膿毒癥大鼠模型建立成功，與既往的研究[10]結果一致。本研究在該模型上探索LMWH對LPS誘導肝細胞損傷的影響，發現LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導的肝細胞損傷，提示LMWH具有肝細胞保護作用。凋亡是細胞死亡的重要方式之一，研究證實LPS可以誘導肝細胞的凋亡[11]。本研究進一步探索了LMWH對LPS誘導肝細胞凋亡的影響，結果顯示LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導的肝細胞凋亡。該研究提示LMWH可能通過抑制細胞凋亡發揮肝細胞保護作用。既往研究發現肝素對體外培養的內皮細胞具有保護作用[12]。筆者既往的研究在動物層面上證實了LMWH能防治膿毒癥肝臟引起的肝損害，而本研究第一次在細胞層面上證實了LMWH具有肝細胞保護作用。

炎癥因子的釋放在膿毒癥肝損傷中起重要作用。LPS可誘導肝臟細胞釋放大量細胞因子，如TNF-α、IL-6等，這些炎癥因子進一步通過炎癥級聯反應生成大量氧自由基和過氧化反應產物，引發膜脂質過氧化級聯反應，破壞肝細胞膜及線粒體膜完整性，引起肝細胞凋亡[13-14]。因此，本研究進一步探索了LMWH對LPS誘導肝細胞釋放炎癥因子的影響。結果顯示，LMWH能劑量依賴性地抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放，這提示LMWH可能通過LPS誘導的炎癥反應抑制肝細胞的凋亡。

NF-κB是一個重要的轉錄因子，幾乎所有類型細胞都存在NF-κB[15]。NF-κB能被多種細胞刺激所激活，包括LPS、氧化應激、細胞因子、紫外線照射等。既往研究證實LPS能通過激活NF-κB誘導肝細胞的凋亡[16]。NF-κB p65是NF-κB轉錄因子復合物的重要組成部分之一，NF-κB p65的Ser536位點被磷酸化是NF-κB被激活的標志[17-18]。為了觀察LMWH對LPS誘導NF-κB激活的影響，筆者檢測了Lo2細胞中NF-κB p65的磷酸化水平。結果顯示LMWH能劑量依賴性地抑制p65的磷酸化，這提示LMWH可能通過抑制NF-κB抑制LPS誘導的肝細胞凋亡。

綜上所述，本研究顯示，LMWH能夠改善LPS誘導的肝細胞損傷和細胞凋亡，一定程度上可緩解LPS誘導的細胞炎癥水平。同時，LMWH能夠抑制LPS誘導NF-κB的激活，提示LMWH可能通過抑制NF-κB發揮其肝細胞保護作用。