“pH對酶活性影響”生物學實驗的改進與創新

黃茗暄

(華南師范大學生命科學學院 廣東廣州 510631)

《普通高中生物學課程標準(2017年版2020年修訂)》(以下簡稱《課程標準》)指出,“科學探究”是生物學核心素養的基本組成,教師應貫徹“教學過程重實踐”的基本理念,并要求教師通過開展探究性學習活動和工程學任務,培養學生的創新精神。人教版生物學教材《必修1·分子與細胞》第五章第一節中設置了“影響酶活性條件”的探究性實驗,旨在加深學生對《課程標準》中重要概念的理解,但學生通過教材中的實驗僅能認識到酶在過酸或過堿的環境中會失活,無法準確理解酶活性隨pH 變化的曲線圖。浙科版和北師大版教材中通過反應小室和量筒實現了酶活性的定量測量,但是不同pH 條件下的酶活性需要分次測量,步驟較為繁瑣,無法實現反應的同步化。因此,下文旨在通過改進實驗方法和自制簡易實驗裝置,幫助學生理解教材中抽象的數學模型,同時為廣大一線教師開展本課教學提供一定的教學參考。

1 分光光度法探究pH 對多酚氧化酶活性的影響

新鮮的豬肝研磨液中過氧化氫酶的活性較高,即使加入少量,分解反應也較為劇烈,因此,僅通過定性觀察氣泡生成的快慢來判斷酶活性的高低,主觀性強,易造成較大的實驗誤差。

教師選用蘋果作為實驗材料,用分光光度法測定不同pH 條件下蘋果中的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性的變化。學生通過記錄同一時間內OD 值的變化數據,構建數學模型,理性認識酶活性隨pH 的變化規律。

1.1 實驗原理

PPO 是一種金屬氧化酶,能催化鄰苯二酚產生醌,導致溶液顏色發生變化。用分光光度計在波長420 nm 處進行比色測定,即可計算出PPO 的活力。用不同pH 的緩沖液處理多酚氧化酶液,測定其15 s內OD 值的變化,即可計算出不同pH 條件下多酚氧化酶的活力。

1.2 實驗用品及準備

1.2.1 實驗用品

紫外可見光分光光度計、勻漿機、水浴鍋、pH 試紙、漏斗、濾紙、玻璃棒、試管、1 000 ul 移液槍(管);0.2 mol/L檸檬酸緩沖溶液,0.2 mol/L 磷酸氫二鉀緩沖溶液、0.2 mol/L 鄰苯二酚溶液(現配現用)、去離子水、新鮮蘋果。

1.2.2 實驗準備

①PPO 酶液的制備

將蘋果切塊,按1 g 果肉組織加入10 mL 去離子水的比例將去離子水補足量(在冰浴中操作),低溫下勻漿2 min 后過濾,取濾液,制得粗酶液,置冰箱密封保存備用。

②緩沖液的配制

用0.2 mol/L 檸檬酸緩沖溶液與0.2 mol/L 磷酸氫二鉀緩沖溶液分別配制pH 為4.0、5.0、6.0、7.0 和8.0 的緩沖液備用。

1.3 實驗步驟

和試驗管(酶液)進行。用分光光度計在波長420 nm處進行比色測定,記錄15 s 內的OD 值變化。

見表1,酶活性測定分為對照管(高溫滅活酶液)

表1 pH 對多酚氧化酶活性影響的實驗步驟

1.4 實驗結果與分析

學生在表1 中記錄數據,并以pH 為橫坐標﹑以A420(15s)-A420(起始)為縱坐標建立數學模型,用計算機或坐標紙繪制曲線圖(圖1),并對曲線進行描述與分析。

圖1 多酚氧化酶活性隨pH 變化的曲線圖

1.5 教學建議

(1)教師應介紹分光光度計的原理和使用方法。雖然高中生物學實驗沒有涉及分光光度計的使用,但是分光光度計可實現高中生物學中部分實驗由定性向定量的轉變,提升實驗的精確度,如雙縮脲法測定蛋白質含量。分光光度計也是大學生物學的常用儀器,教師將其應用于高中實驗教學,能有效開拓學生的學科視野和提升學生的實驗能力,讓學生感受到技術發展對科學研究的促進意義。若學校不具備分光光度計等實驗儀器,教師可基于多酚氧化酶對pH 變化敏感的特性,引導學生進行顏色觀察。教師制作比色卡,規定反應顏色的不同等級,學生利用比色卡對PPO 的活性進行估計。

(2)多酚氧化酶的概念對高中階段的學生而言較為陌生,可能導致學生難以理解實驗原理。此時,教師可以聯系生活實際,以蘋果暴露于空氣中易褐變的生活現象引出PPO 的催化氧化功能。考慮到學生的化學基礎,針對鄰苯二酚被氧化生成醌的反應,教師只需點明其為氧化還原反應,并指出PPO 催化該反應,導致溶液顏色變深,顏色變化越快,說明多酚氧化酶的活性越高。

(3)在實驗準備部分,制備酶液時應盡量減少其暴露在空氣中的時間,由于操作要求較高且涉及勻漿機和刀具的使用,因此,酶液的制備建議由實驗員完成,學生只需完成表1 相關步驟即可。

(4)用分光光度法測定多酚氧化酶的活性也適合用于探究溫度對酶活性的影響、酶的專一性和高效性,教師以PPO 為材料,貫穿“酶的特性”章節教學,一材多用,能夠幫助學生構建完整的知識體系。

(5)在課程最后,教師可以鼓勵學生為蔬果的保鮮、防褐變等提出有效建議,通過聯系生產實踐升華知識內容,提升學生的責任意識。

2 同時間測定酶活性的實驗裝置

在測定酶活性時,各版本教材中采用的實驗裝置各不相同,浙科版、蘇教版和滬科版均用不同的裝置對酶活性進行了定量測定,但是均無法實現實驗組酶活性的同步測定,且步驟冗雜,現象不夠直觀。教師設計了如圖2所示的實驗裝置圖,該裝置既實現了定量測量,又實現了酶促反應的同時發生。教師選用H2O2和豬肝研磨液作為材料,利用物理學中的大氣壓原理,當松開各試管上端的分止水夾時,H2O2溶液不會注入各試管中,而當松開裝置最上端的總止水夾時,各導管中的H2O2溶液同時注入各試管中,從而保證各組實驗同時展開。學生通過記錄水槽中倒置的量筒內排水的體積,得到實驗數據,繪制酶活性變化的曲線圖,理解教材中酶活性隨pH 變化規律的拋物線。教師幫助學生從簡單的定性觀察形成感性認知上升為定量實驗形成理性認知。

圖2 改進實驗裝置左視圖(A)與正視圖(B)

2.1 實驗用品

鐵架臺、止水夾、導管、10 mL 試管5 支、橡膠塞、50 mL 量筒5 支、移液槍(管)、水槽;3%過氧化氫溶液(現配現用),20%新鮮肝臟研磨液、pH 為1.0、4.0、7.0、10.0 和13.0 的緩沖液、去離子水等。

2.2 實驗步驟

學生分組實驗,根據表2 步驟進行pH對酶活性的影響探究。

表2 pH 對過氧化氫酶活性影響的實驗步驟

2.3 實驗結果與分析

學生在表2 中記錄數據,并以pH 為橫坐標﹑以量筒內排水的體積(mL)為縱坐標建立數學模型,用計算機或坐標紙繪制曲線圖(圖3),并對曲線進行描述與分析。

圖3 過氧化氫酶活性隨pH 變化的曲線圖

2.4 教學建議

(1)本實驗是綜合運用多種學科知識解決問題的良好的跨學科教學素材,實驗做出的改進是培養學生關注多元問題,將酶活性相關實驗中的生物學知識與化學、物理、數學等其他學科的已有知識聯系起來,符合奧蘇伯爾的有意義學習理論。實驗過程中,教師可給予啟發性的引導材料,學生可以自主設計實驗裝置,下文展示了教師啟發學生的主要過程。①教師按照人教版實驗步驟,以視頻或動手實驗的方式讓學生了解或完成實驗,并向學生提出問題:你在實驗過程中發現了什么問題?是否有更為精確的方法測定過氧化氫酶的活性?②教師提供聯系初中化學知識的相關材料,如過氧化氫分解制備氧氣的實驗原理和實驗裝置(圖4),從而啟發學生,并設置問題串:是否可以改進這個裝置實現定量測定?如何使集氣管內不可見的氣體可視化?如何測定集氣瓶內氣體的體積?③教師提供聯系初中物理知識的相關材料,如密封容器內外大氣壓平衡原理以及瓶子扎孔不漏水的小實驗,并引導學生思考:如何使反應酶液同時注入五支試管中?如何控制酶促反應同時發生和停止?④教師引導學生開展實驗,學生記錄同一時間內各量筒內排水的體積后,進行數學建模,綜合運用數學知識和生物知識對圖像進行分析和描述。

圖4 過氧化氫分解制備氧氣實驗裝置

(2)教師在實驗過程中發現,堿性環境會導致過氧化氫的分解。實驗中可能會出現pH 為10.0 的反應試管產生氣體的量大于pH 為7.0 的試管的現象。這可能會導致學生誤認為,與pH 為7.0 的環境相比,過氧化氫酶的活性在pH 為10.0 的環境中更高,此時,教師可以提供相關材料:過氧化氫是一種代謝廢物,豬肝中的過氧化氫酶能夠快速分解體內代謝產生的過氧化氫,防止其損害機體,豬肝中的pH 大約為6.8,因此,在功能正常的豬肝臟中,過氧化氫酶的最適pH 為6.8 左右。教師通過材料引起學生的認知沖突,鼓勵學生課后自主設計方案并實施來探究堿性環境對過氧化氫分解的影響,并讓學生嘗試排除堿性環境對過氧化氫酶活性檢測的干擾。

(3)為方便學生對量筒內的氧氣體積進行準確讀數,教師可在水槽中滴加幾滴墨水。

(4)本實驗裝置不僅適于探究pH對酶活性的影響,同樣適于探究不同溫度下酶活性的高低,以及酶的專一性和高效性,實驗裝置用途廣泛,直觀高效。

3 總結與啟示

科學探究是生物學核心素養的重要組成,是科學本質教學中的有效策略。在生物學教學過程中,教師應重視教材中有關實驗探究的內容,深挖教材,引導學生開展有意義的科學探究活動,幫助學生建立生物學觀點,理解科學本質和科學概念。

實驗的改進和創新離不開教師的知識沉淀和日積月累的實踐經驗,同樣也離不開學生與生俱來的好奇心,教師要尊重實驗過程中學生提出的每一個問題,并與學生共同商討解決方案,最大限度地挖掘和鍛煉學生的質疑精神和實驗能力,進而使教學達成科學思維、科學探究等核心素養的培養目標。