大豆皂苷調控miR-584-5p/HDAC1通路對子宮內膜癌細胞增殖及凋亡的影響

帥仁亞，李晴宇，范敏慧，徐煒

1.杭州市腫瘤醫院藥學部，浙江杭州 310002；2.杭州市第一人民醫院吳山院區藥學部，浙江杭州 313000；3.杭州市腫瘤醫院中西醫結合腫瘤科，浙江杭州 310002

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）近年來發病率逐年增高，對廣大女性健康造成極大威脅[1-2]。組蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase1，HDAC1）屬于一種致癌因子，與腫瘤的發生和發展密切相關，在肝細胞癌、乳腺癌、子宮內膜腫瘤等多種腫瘤組織及細胞中呈強陽性表達，下調其表達可顯著抑制肝癌、乳腺癌與神經母細胞瘤細胞增殖，發揮很好的抗癌活性[3-4]。研究發現，微小RNA-584?5p（microRNA-584?5p，miR-584?5p）是一種具有抑癌活性的微小RNA，在髓母細胞瘤、非小細胞肺癌和胃癌等癌組織中低表達，上調miR?584?5p 表達可顯著抑制非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲，誘導髓母細胞瘤細胞DNA 損傷和凋亡，這表明miR-584-5p/HDAC1 通路可作為潛在的EC 治療靶點[5-7]。大豆皂苷具有抗癌、增強免疫力等藥理功效，可減輕腫瘤耐藥及血管新生，抑制癌細胞增殖并促使其凋亡，發揮較強的抗腫瘤作用，因而推測大豆皂苷可防治EC[8-9]。本研究通過體外培養EC 細胞系HEC-1-A，探討大豆皂苷調控miR-584-5p/HDAC1通路對EC 細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞

人EC 細胞系HEC-1-A（武漢普諾賽生命科技有限公司）；大豆皂苷[純度高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）≥98%，批號：51330-27-9，上海吉至生化科技有限公司]；高效放射免疫沉淀測定（radio-immune precipitation assay，RIPA）裂解液、總RNA 提取試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、實時聚合酶鏈反應主混合物（SYBR green real time PCR master mix）、細胞計數試劑盒8（cell counting Kit-8，CCK-8）、逆轉錄試劑盒、膜聯蛋白-V（annexin V）-熒光素異硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidine iodide，PI）凋亡檢測試劑盒、DMEM 培養基（含雙抗）、LipofectamineTM2000、優級胎牛血清（北京索萊寶科技有限公司）；兔源B 淋巴細胞瘤-2 相關X 蛋白（B-cell lymphoma-2-associated X protein，Bax）抗體、兔源β-actin 抗體、兔源增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、兔源天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9（cysteine-containing aspartatespecific proteases 9，caspase-9）抗體、羊抗兔二抗、兔源HDAC1 抗體（美國Abcam 公司）等。

1.2 主要儀器

全波長全自動酶標儀（瑞士Tecan 公司，型號：M200 PRO）；流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司，型號：CytoFLEX）；實時熒光定量PCR 系統（美國應用生物系統公司，型號：ABI 7500）；蛋白電泳儀、轉膜儀（美國伯樂公司，型號：Mini-PROTEAN Tetra、Power-pac 3000）；凝膠成像系統（法國威爾勃公司，型號：INFINITY 3026）等。

1.3 HEC-1-A 細胞培養并檢測半數抑制濃度

快速復蘇人EC 細胞系HEC-1-A，以細胞培養液（DMEM 培養基+10%優級胎牛血清）混勻后接種培養，傳代后接種在96 孔板，每孔細胞約1×104個，培養過夜后，將大豆皂苷溶于DMEM 培養基中，配制為1.6mg/ml 的儲備液，分別以終濃度0μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml 的大豆皂苷處理，每組濃度設6 個重復孔，并取6 個不接種細胞的培養孔，作空白對照（空白組）[10]。48h 后加入CCK-8，同時換新細胞培養液，3h 后通過酶標儀測定各孔吸光度（450nm 波長），計為A 值，計算細胞活力及評測半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值，細胞活力=（實驗組A 值–空白組A 值）/（對照組A 值–空白組A 值）×100%。

1.4 細胞分組處理及樣品收集

根據1.3 中HEC-1-A 細胞IC50值，選擇100μg/ml的大豆皂苷濃度進行后續實驗。取傳代HEC-1-A 細胞接種在24 孔板，隨機分為對照組、大豆皂苷組、miR-584-5p 抑制劑組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對照組，大豆皂苷組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組及大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對照組細胞以終濃度100μg/ml 的大豆皂苷處理，同時miR-584-5p 抑制劑組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對照組參照說明書指導步驟及參考文獻以miR-584-5p 抑制劑、miR-584-5p 抑制劑陰性對照對應轉染細胞，48h 后收集各組細胞，重復操作3 次，收集3 份細胞[11]。

1.5 各組細胞增殖檢測

取傳代HEC-1-A 細胞接種在96 孔板，以1.4 中的方法分組處理后，按照1.3 中CCK-8 實驗步驟檢測出各組細胞活力。

1.6 各組細胞凋亡檢測

以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）分別重懸1.4 中收集的一份細胞，混勻計數，測出細胞密度，并調至1×106個/ml，取1ml 進行離心，所得細胞沉淀以PBS 洗滌，再次離心，以500 μl 結合緩沖液重懸細胞沉淀，依次加入5μl PI、10μl annexin V-FITC 后吹打混勻，孵育（37.5℃，避光）15min，離心后，以PBS 洗滌細胞，加入300μl PBS，重懸細胞，吹打混勻，采用流式細胞儀檢測各組凋亡情況。

1.7 各組細胞miR-584-5p、HDAC1 mRNA 表達檢測

以試劑盒提取1.4 中收集的一份細胞總RNA 后做逆轉錄實驗，獲得各組細胞模板cDNA，預先配制實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）實驗反應預混液（ROX 染料0.4μl+上、下游引物各0.8μl+焦碳酸二乙酯處理的水6 μl+實時聚合酶鏈反應主混合物10μl），加入cDNA 后混勻，上機進行熒光定量PCR 擴增，miR-584-5p 內參選用U6，HDAC1 內參選用GAPDH，運用2-ΔΔCt算法計算出miR-584-5p、HDAC1 mRNA 相對表達。各基因引物序列見表1。

1.8 各組細胞HDAC1 蛋白、PCNA 及caspase-9、Bax 表達檢測

以高效RIPA 裂解液提取1.4 中最后一份細胞總蛋白，并以BCA 法測量其濃度，將蛋白煮沸6min變性后每組各取20μg 總蛋白行SDS-PAGE 凝膠電泳（110V，1.5h），接著以110V 電壓濕轉1.5h，所得硝酸纖維膜置入3%牛血清白蛋白溶液中封閉（室溫，1.5h），以剪刀截下HDAC1、PCNA、caspase-9、Bax 及β-actin 蛋白條帶，采用相對應一抗孵育（4℃，12h）后洗滌，然后采用二抗孵育（室溫，2h）后洗滌，顯色后拍照，圖像采用軟件Image J 進行定量分析，最終得到各組目的蛋白相對表達。

1.9 統計學方法

采用SPSS 24.0 統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度大豆皂苷對HEC-1-A 細胞增殖的影響

不同濃度大豆皂苷可抑制HEC-1-A 細胞生長，且在一定范圍內隨其濃度升高作用增強，IC50為98.56μg/ml，見表2。

表2 不同濃度大豆皂苷對HEC-1-A 細胞增殖的影響（±s ，n=6）

表2 不同濃度大豆皂苷對HEC-1-A 細胞增殖的影響（±s ，n=6）

注：與0μg/ml 的大豆皂苷比較，*P<0.05

大豆皂苷濃度（μg/ml） 細胞活力（%）0 100.00±0.00 20 84.67±11.45*40 68.02±6.38*80 57.12±5.67*120 41.56±4.32*160 40.38±4.03*

2.2 各組間HEC-1-A 細胞活力的比較

與對照組[（100.00±0.00）%]相比，大豆皂苷組[（52.14±6.11）%]與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對照組[（53.02±7.65）%]細胞活力降低（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組[（153.23±15.34）%]細胞活力升高（P<0.05）。與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組[（97.06±5.92）%]相比，大豆皂苷組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對照組細胞活力降低（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細胞活力升高（P<0.05）。

2.3 大豆皂苷對HEC-1-A 細胞凋亡的影響

與對照組[（8.06±0.67）%]相比，大豆皂苷組[（56.48±7.91）%]與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對照組[（56.03±8.14）%]細胞凋亡率升高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組[（2.35±0.33）%]細胞凋亡率降低（P<0.05）。與大豆皂苷+miR-584-5p抑制劑組[（8.64±1.20）%]相比，大豆皂苷組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對照組細胞凋亡率升高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細胞凋亡率降低（P<0.05），見圖1。

圖1 大豆皂苷對HEC-1-A 細胞凋亡的影響

2.4 大豆皂苷對HEC-1-A 細胞增殖及凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組相比，大豆皂苷組與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對照組細胞增殖相關蛋白PCNA 表達降低（P<0.05），凋亡相關蛋白caspase-9、Bax 表達增高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細胞增殖相關蛋白PCNA 表達增高（P<0.05），凋亡相關蛋白caspase-9、Bax 表達降低（P<0.05）。與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組相比，大豆皂苷組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對照組細胞增殖相關蛋白PCNA 表達降低（P<0.05），凋亡相關蛋白caspase-9、Bax 表達增高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細胞增殖相關蛋白PCNA 表達增高（P<0.05），凋亡相關蛋白caspase-9、Bax 表達降低（P<0.05），見圖2、表3。

圖2 大豆皂苷對HEC-1-A 細胞增殖及凋亡相關蛋白表達的影響

表3 各組細胞增殖及凋亡相關蛋白相對表達（±s ，n=6）

表3 各組細胞增殖及凋亡相關蛋白相對表達（±s ，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組比較，#P<0.05

組別 PCNA/β-actin caspase-9/β-actin Bax/β-actin對照組 1.43±0.37 0.61±0.07 0.55±0.08大豆皂苷組 0.71±0.13*# 1.38±0.19*# 1.27±0.16*#miR-584-5p 抑制劑組2.05±0.54*# 0.25±0.05*# 0.20±0.04*#大豆皂苷+miR-584-5p抑制劑組 1.39±0.30 0.63±0.08 0.59±0.11大豆皂苷+miR-584-5p抑制劑陰性對照組 0.70±0.18*# 1.40±0.21*# 1.29±0.22*#

2.5 大豆皂苷對HEC-1-A 細胞miR-584-5p/HDAC1通路表達的影響

與對照組相比，大豆皂苷組與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對照組細胞HDAC1 mRNA及蛋白表達降低（P<0.05），miR-584-5p 表達增高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細胞HDAC1 mRNA 及蛋白表達增高（P<0.05），miR-584-5p 表達降低（P<0.05）。與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組相比，大豆皂苷組、大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑陰性對照組細胞HDAC1 mRNA 及蛋白表達降低（P<0.05），miR-584-5p 表達增高（P<0.05）；miR-584-5p 抑制劑組細胞HDAC1 mRNA 及蛋白表達增高（P<0.05），miR-584-5p 表達降低（P<0.05），見圖3、表4。

圖3 大豆皂苷對HEC-1-A 細胞HDAC1 蛋白表達的影響

表4 各組細胞miR-584-5p、HDAC1 mRNA 及蛋白相對表達（±s ，n=6）

注：與對照組比較，*P<0.05；與大豆皂苷+miR-584-5p 抑制劑組比較，#P<0.05

mRNA 相對表達 蛋白相對表達組別miR-584-5p/U6 HDAC1/GAPDH HDAC1/β-actin對照組 0.97±0.17 1.00±0.18 0.85±0.13大豆皂苷組 2.47±0.49*# 0.39±0.09*# 0.28±0.08*#miR-584-5p 抑制劑組 0.41±0.06*# 2.21±0.40*# 1.84±0.34*#大豆皂苷+miR-584-5p抑制劑組 1.01±0.20 0.96±0.15 0.82±0.12大豆皂苷+miR-584-5p抑制劑陰性對照組 2.46±0.51*# 0.40±0.11*# 0.27±0.07*#

3 討論

手術切除子宮、卵巢后輔助放化療是目前EC 的標準臨床治療手段，分子靶向治療、基因治療等新型療法亦得到補充應用，患者生存率有所提高，但費用昂貴，療效也未達到預期，因此還需尋找更為有效價廉的治療策略[12-14]。天然皂苷類產物可促使腫瘤細胞凋亡，提高其對化療藥物的敏感性，起到抗腫瘤的功效，大豆皂苷是大豆、黃精等植物中含有的主要活性成分，可有效抑制卵巢癌增殖及遷移侵襲[15-16]。本研究顯示大豆皂苷可抑制HEC-1-A 細胞生長，且在一定范圍內隨濃度升高作用增強，根據IC50值選擇大豆皂苷最佳作用濃度對HEC-1-A 進行處理后，發現大豆皂苷可降低HEC-1-A 細胞活力、PCNA 蛋白表達，增高細胞凋亡率、caspase-9 及Bax蛋白表達，表明大豆皂苷可下調增殖相關蛋白表達，促進凋亡蛋白表達，降低HEC-1-A 細胞活力，誘導其凋亡，對EC 具有抗癌活性。

HDAC1 是一種組蛋白脫乙酰酶，在包括子宮內膜腫瘤在內的多種腫瘤中起致癌作用，抑制HDAC1表達，升高活性氧水平，觸發宮頸癌細胞凋亡[17-18]。HDAC1 過表達與胃癌患者預后不良呈正相關，可抑制胃癌異種移植瘤生長[19]。miR-584-5p 是具有抗癌作用的微小RNA，在肝癌、非小細胞肺癌和胃癌等腫瘤組織中表達降低，過表達miR-584-5p 基因可抑制非小細胞肺癌細胞的遷移、增殖和侵襲，顯著促使肝癌細胞凋亡過程，這些結果表明，miR-584-5p/HDAC1 通路可作為EC 治療的作用靶點[20]。結果顯示，大豆皂苷可降低HEC-1-A 細胞HDAC1 mRNA 及蛋白表達，升高miR-584-5p 表達；以miR-584-5p 抑制劑下調HEC-1-A 細胞miR-584-5p 表達，可增強其增殖，抑制其凋亡，并可減弱大豆皂苷對HEC-1-A 細胞凋亡的促進作用，逆轉大豆皂苷對EC 的抗腫瘤功效，提示大豆皂苷可調控miR-584-5p/HDAC1 通路促使EC細胞凋亡，抑制其增殖。

綜上所述，大豆皂苷可上調miR-584-5p 表達，降低HDAC1 表達，減輕EC 細胞增殖，并誘導其凋亡發生，調控miR-584-5p/HDAC1 通路表達是其發揮抗癌作用的分子機制之一，本研究結果證實大豆皂苷對EC 具有較大的治療潛力。