原發性膽汁性膽管炎伴抑郁小鼠的肝腸損傷及腸黏膜中ZO-1的表達變化

張紫陽，王晶

1.包頭醫學院研究生學院，內蒙古包頭 014040；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院消化內科，內蒙古包頭 014031

原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）曾稱“原發性膽汁性肝硬化”，是一組因自身免疫破壞肝內膽管并形成膽汁淤積性肝病[1-2]。本病臨床表現因個體差異而不同，多數患者發病初期并無臨床表現，部分患者可出現疲乏、惡心、腹瀉、上腹部不適等非特異性臨床癥狀及倦怠、抑郁、記憶力下降等中樞神經系統癥狀[3]。其中，抑郁作為一種中樞神經系統癥狀在PBC 患者中較為常見。國內外研究表明，腸道黏膜屏障與多種肝病的發生、發展關系密切[4]。腸道黏膜屏障主要包括生物、機械、免疫及化學屏障，其中機械屏障中閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens protein 1，ZO-1）是腸黏膜屏障中的重要組成成分，ZO-1 在腸道中的表達情況反映腸道損傷程度[5]。另有研究發現，胃腸道疾病與腸–腦軸關系密不可分，1996年WOOD 提出中樞神經系統及胃腸道功能可通過多種途徑進行雙向調控，通過既往研究推測腸–腦軸的相互作用有望成為改變腸道功能的治療手段[6]。本研究通過建立PBC 伴抑郁模型初步探究腸–腦軸的相互影響及腸–肝軸的相互作用，以期為PBC 的臨床防治工作提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選用24 只6 周齡雌性C57BL/6 小鼠[許可證號：SCXK（京）2019-0010]，體質量（16±1）g。本研究經內蒙古科技大學包頭醫學院倫理委員會審批通過（倫理審批號：ZX-012）。

1.1.2 實驗藥物 0.1%3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲基吡啶（3,5-diethyloxycarbonyl-1,4-dihydro-2,4,6-trimethylpyridine，DDC）[許可證號：SCXK（京）2018-0006]；鹽酸氯米帕明（clomipranine hydrochloride）化學單體（規格：500mg，CAS：17321-77-6），純度99.14%，購自北京瀚海拓新生物技術有限公司。

1.1.3 主要試劑 胞質閉鎖小帶蛋白（生產批號：bs-23835R，生產單位：北京博奧森生物技術有限公司）、抗體稀釋液（生產批號：C01-04001，生產單位：北京博奧森生物技術有限公司）、即用型免疫組化UltraSensitiveTMSP 試劑（鼠/兔）檢測試劑盒（生產批號：KIT-9710，生產單位：福州邁新生物技術開發有限公司）、PBS（生產批號：PBS-0060，生產單位：福州邁新生物技術開發有限公司）、DAB（二氨基聯苯胺）顯色試劑盒（生產批號：DA1010，生產單位：北京索萊寶科技有限公司）、抗原修復液（生產批號：C1034，生產單位：北京索萊寶科技有限公司）。

圖1 4 組小鼠的肝組織病理學表現（HE 染色，×200）

圖2 4 組小鼠的腸組織病理學表現（HE 染色，×200）

圖3 ZO-1 在4 組小鼠的腸組織免疫組化表現（×400）

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及造模 24 只小鼠正常喂養7d 后，隨機分為4 組：對照組、PBC 組、PBC+抑郁組、PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組，每組6 只。根據不同實驗組造模需求，抑郁組小鼠在適應性喂養1 周后采用慢性不可預知的輕度刺激方式（隨機采用搖尾、束縛、熱水浴、濕籠、冷水浴、鼠籠傾斜、禁飲、禁食）干預[7]；PBC 組小鼠于抑郁刺激1 周后同時給予含0.1%DDC 飼料飲食8 周，根據文獻選用腹腔注射方式給予小鼠氯米帕明干預[8-10]。腹腔注射模型組小鼠于PBC 造模第9 周時于每日同一時間給予腹腔內注射氯米帕明7.5mg/kg 共2 周以誘導模型。對照組小鼠給予同劑量維持飼料、生理鹽水。造模完成后處死小鼠，處死前測量小鼠最終體質量并分析是否存在差異以判斷造模情況，采集小鼠的肝組織及腸組織，用生理鹽水沖洗干凈，用于后續實驗。

1.2.2 常規病理染色 將小鼠的肝組織和腸組織切成適當小塊，將需觀察的組織進行常規石蠟包埋形成蠟塊，切片厚度3μm，切片經二甲苯、梯度乙醇脫蠟脫水，先蘇木精染核、分化、反藍，最后伊紅染質，干燥封片，置顯微鏡下拍照、觀察。

1.2.3 免疫組織化學檢測 腸組織切成適當小塊，將組織固化后用石蠟包埋法制成蠟塊，切片厚度為3μm，75℃烤片脫蠟、組織脫水、抗原修復，流水沖洗阻斷，放至室溫，滅活過氧化物酶及非特異染色，隨后加一抗：胞質ZO-1（1∶100），4℃過夜，取出復溫后加入二抗并標記二抗，使用DAB 染色至適當，蒸餾水沖洗、復染、乙醇分化、酒精脫水，晾干，蓋玻片封片。光鏡低倍鏡下瀏覽整張切片，選擇高表達區，改用高倍鏡隨機選擇3 個及以上視野拍照，并用Image pro Plus 軟件半定量測量法計算切片累計吸光度值，用于結果判定[11]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，各組之間的比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠的體質量分析

與對照組小鼠的體質量[（20.55±1.20）g]比較，其余各組小鼠的體質量均明顯下降（P<0.05）；PBC+抑郁組小鼠的體質量[（16.01±1.05）g]較PBC 組小鼠[（18.45±1.44）g]減輕（P<0.05）；PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的體質量[（18.14±0.85）g]較PBC+抑郁組小鼠明顯升高（P<0.05）。

2.2 肝組織病理學比較

對照組小鼠的肝小葉結構正常，肝細胞放射狀排列形成肝板，肝竇內未見充血，門靜脈區未見明顯炎性反應，膽管結構正常。PBC 組可見肝臟炎性細胞增多，并伴有膽管擴張及少量膠原沉積。PBC+抑郁組可見肝小葉結構顯著破壞，大量炎癥細胞增生、膽管增生并擴張，膽管內出現膽汁及肝臟膠原纖維沉積。PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的肝臟病理損傷較PBC+抑郁組明顯減輕，見圖1。

2.3 腸組織病理學比較

對照組小鼠的腸黏膜未見損傷，絨毛整齊，腺體結構正常。PBC 組、PBC+抑郁組、PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的腸黏膜可見不同程度病理損害，PBC 組小鼠的腸黏膜絨毛稀疏、變細、萎縮且排列雜亂，偶可見腺體變形萎縮、上皮及固有層間隙增大、分離。PBC+抑郁組小鼠的腸黏膜結構出現較嚴重病理損傷，絨毛稀疏且高度降低，并呈現不同程度的壞死、脫落、萎縮，排列雜亂，腺體出現明顯的變形萎縮，大量炎癥細胞匯聚在黏膜下層，并見上皮及固有層間隙增大，可至中度分離。PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的腸黏膜損傷較PBC+抑郁組減輕，可見腸黏膜絨毛排列雜亂，伴少量絨毛頂端脫落、上皮下間隙增大，見圖2。

2.4 腸組織免疫組織化學染色比較

光鏡顯示對照組小鼠的腸黏膜中ZO-1 均勻、連續分布在細胞膜及細胞質中，并在整張切片中表達為強陽性，累計吸光度值（109.68±16.15）；PBC 組、PBC+抑郁組、PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的ZO-l 分布不均，呈淺棕色，細胞邊緣線狀信號模糊不清，ZO-1 累計吸光度值分別為（33.16±4.69）、（17.45±2.67）、（39.86±1.80）；PBC 組、PBC+抑郁組、PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的ZO-1累計吸光度值均明顯低于對照組小鼠（P<0.01）；PBC+抑郁組小鼠的ZO-1 累計吸光度值低于PBC 組小鼠（P<0.01）；PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的ZO-1 累計吸光度值高于PBC+抑郁組小鼠（P<0.01），見圖3。

3 討論

PBC 的發生、發展與腸道黏膜屏障功能關系密切已被廣泛認可。腸道及肝臟的胚胎起源相同，這可更好地解釋兩者間相互影響共同維持機體穩定。Marshall[12]最早提出腸–肝軸概念并被廣泛接受，強調腸道結構或功能異常可影響膽汁酸進入腸道，破壞腸道菌群正常繁殖并激活腸道免疫反應，腸道產生的非正常衍生物通過血液循環或淋巴系統進入遠隔器官如肝臟，大量有害物質超出肝臟的解毒處理能力，引起繼發性肝損傷和肝內免疫系統的紊亂。膽汁淤積會進一步損傷肝臟，加重膽汁淤積，影響膽汁酸的腸–肝軸循壞，造成腸道菌群紊亂，腸道細菌的異常繁殖導致腸黏膜屏障功能進一步受損[13-14]。腸黏膜細胞間連接主要包括黏附型連接、緊密型連接及縫隙型連接。緊密連接蛋白中的跨膜蛋白及胞漿蛋白共同維持腸黏膜屏障功能，ZO-1 作為胞漿蛋白的代表充當腸黏膜細胞間的骨架成分并與跨膜蛋白互相連接，使腸細胞連接形成網狀結構而更加穩定[15-16]。本研究通過構建膽汁淤積型肝損傷模型證實肝功能受損與腸道黏膜屏障及ZO-1的表達關系密切。正常情況下，ZO-1 均勻、連續分布在腸細胞的質或膜中并呈強陽性表達，如本實驗中的對照組。當膽汁淤積時，腸道菌群紊亂及腸道通透性增加，致使緊密連接被破壞表現為腸道中ZO-1 表達下調，在切片中觀察到ZO-1 呈現弱陽性且斷續、不均勻分布于腸細胞的膜及質中。

目前的科學研究已證實中樞神經系統的負性情緒與胃腸道之間存在相互作用。一方面，負性情緒包括焦慮、抑郁等均可使人體發生應激反應影響機體的腸道通透性，降低腸道黏膜屏障功能，激活腸黏膜免疫反應并導致腸道菌群紊亂，引發機體炎癥發生；另一方面腸道黏膜屏障受損或腸道菌群失衡通過作用于神經系統、免疫系統及內分泌系統等多種途徑影響大腦的結構和功能導致行為異常[17]。研究顯示抑郁癥患者的腸道菌群構成與健康志愿者存在明顯差異[18]。5-羥色胺作為一種重要的神經遞質被廣泛研究，其在腸道微生物–腸–腦軸中占據重要地位[19]。PBC 患者較易并發抑郁癥狀，本實驗中構建PBC 伴抑郁小鼠模型并采用鹽酸氯米帕明降低5-羥色胺再攝取以改善抑郁癥狀，從而改善腸道菌群失調及腸道黏膜屏障功能，進而通過腸–肝軸的相互作用改善肝臟損傷。本研究結果顯示PBC+抑郁小鼠的肝腸病理損傷嚴重，與免疫組化檢測ZO-1 表達結果一致，PBC+抑郁+腹腔注射氯米帕明組小鼠的ZO-1表達較PBC+抑郁組小鼠明顯上調，說明抗抑郁治療可改善腸道功能，修復腸黏膜屏障。

綜上所述，本研究通過動物實驗證實膽汁淤積型肝損傷同時損傷腸道黏膜屏障，且抑郁小鼠的腸道損傷進一步加重。改善抑郁癥狀可使腸黏膜中ZO-1 表達上調，通過改變緊密連接蛋白的表達和分布而影響腸黏膜通透性及腸道黏膜屏障功能，進而通過腸–肝軸改善肝臟功能。本研究的局限性在于并未進行腸道微生態及腸–腦軸的作用機制研究。