藁本內酯衍生物對軟骨細胞外基質合成與分解代謝影響

劉建軍 陳欣, 汪欣月 齊偉 王多賢 席芳琴 李寧, 柳軍璽 謝興文,*

1.甘肅中醫藥大學附屬醫院,甘肅 蘭州 730000 2.甘肅中醫藥大學,甘肅 蘭州 730000 3.北京中醫藥大學,北京 100029 4.中國科學院蘭州化學物理研究所,甘肅 蘭州 730000

骨關節炎(osteoarthritis,OA)以關節軟骨退變為病理特征,是影響中老年人群關節功能的主要疾病[1]。非甾體類藥物抗炎止痛治療OA,長期服用存在消化道出血風險。目前,臨床尚缺乏既能夠抗炎又能夠延緩軟骨退變的藥物治療OA。軟骨細胞外基質是關節軟骨的重要組成部分,影響軟骨生物力學功能和軟骨細胞間信號轉導等細胞行為。軟骨細胞外基質代謝穩態在OA關節退變中發揮著重要作用[2]。自身免疫炎癥反應是OA軟骨細胞外基質破壞的主要的原因[3]。滑膜細胞和巨噬細胞釋放炎癥因子激活基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)和Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS),抑制細胞外基質中的Ⅱ型膠原α1鏈(COL2α1)和蛋白多糖(ACAN)表達,使軟骨組織發生退變導致OA的發生[4-5]。因此,延緩軟骨細胞外基質分解、促進合成代謝是OA防治的重要方向。

藁本內酯(Z-ligustilide,LIG)是中藥當歸的主要活性成分,具有抗炎活性,能保護軟骨細胞,延緩OA軟骨退變的優勢,但是藁本內酯常溫容易分解,化學性質不穩定[6-7]。藁本內酯衍生物(ligusticum cycloprolactam,LIGc)保留了LIG活性的結構衍生物,具有生物利用度高,常溫下化學性質穩定的優勢(如圖1)[8-9]。LIGc對OA的作用未見報道,本研究通過探究藁本內酯衍生物調節軟骨細胞外基質合成與分解代謝作用,為其延緩軟骨退變治療OA提供實驗依據。

圖1 LIG藁本內酯與藁本內酯衍生物化學結構式

1 材料與方法

1.1 試劑

藁本內酯衍生物相對分子質量247,純度≥98%。大鼠軟骨細胞購自北納創聯生物科技有限公司(2021061311501),IL-1β購自Peprotech公司(批號:H0921DMEM)。CCK8試劑夠自NCM Biotech公司(批號:20220507)、RIPA裂解液購自Servicebio公司(批號:CR2101120)、RNAex Pro RNA提取試劑(批號:A3A2161)、Evo M-mLV 反轉錄預混型試劑盒(批號:A3A1403)、SYBR Green Pro Taq HS預混型RT-qPCR試劑盒(批號:A3A1983)均購自Accurate Biotechnology公司。COX-2一抗(批號:31296111P56)購自BOSTER公司,HMGB1(批號:BA07071406)、NF-κB P65一抗(批號:AH04138226)購自Bioss公司、TLR4一抗(批號:GR271818-5)購自Abcam公司。

1.2 細胞分組及造模

大鼠軟骨細胞用含有10%胎牛血清培養液1640進行培養并隔日換一次液。10 ng/mL IL-1β誘導軟骨細胞炎癥損傷模型。實驗分為對照組和IL-1β組、藁本內酯衍生物高劑量組(0.4 μmol/mL)、中劑量組(0.2 μmol/mL)組和低劑量組(0.1 μmol/mL)組,除空白對照組組外,每組分別加入10 ng/mL的IL-1β處理軟骨細胞,30 min后加入不同濃度的藁本內酯衍生物LIGc孵育24 h。

1.3 CCK8法檢測細胞活性

無菌條件下將大鼠軟骨細胞均勻接種在96孔板上,在恒溫培養箱中孵育過夜,按照要求濃度進行藥物處理,并設置空白對照和正常細胞對照組,繼續放入培養箱培養24 h后向每孔加入10 μL CCK8溶液將培養板在培養箱內孵育2 h,1 000 r/min離心10 min,分離并丟棄上清液,每孔加入DMSO 150 mL,平板振蕩10 min后,在酶標儀450 nm處測吸光度OD值,根據OD值計算細胞的存活率。

1.4 細胞免疫熒光檢測

對96孔板內培養的各組大鼠軟骨細胞IL-1β與藁本內酯衍生物干預處理后用PBS洗3次,加入多聚甲醛固定30 min,隨后順序加入2% Triton X-100進行透化處理15 min后用檸檬酸鈉進行熱修復2次,每次5 min。孔板中滴加正常山羊血清封閉后常溫孵育30 min,再用無菌濾紙去除血清再直接滴加第一抗稀釋液(1∶100),濕盒中4 ℃冰箱過夜,常溫下復蘇后用PBS洗滌3次,每次5 min。再次滴加二抗常溫孵育1 h,PBS洗滌3次,每次5 min。滴加DAPI常溫孵育10 min,PBS洗滌3次,每次5 min。用抗熒光淬滅劑封片同時使用熒光顯微鏡和圖像采集系統采集圖像。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(realtime-quantitativepolymerasechainreaction,RT-qPCR)檢測基因表達

在上述實驗分組的情況下收集細胞進行總RNA的提取及測定。用Trizol法提取總RNA,采用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA,采用3步法進行PCR反應程序并依據溶解曲線對擴增產物特異性進行判定。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參,相對表達量用2-△△CT法分析。引物合成使用PrimerPremier 5.0軟件。引物序列見表1。

表1 實時定量聚合酶鏈反應引物序列

1.6 蛋白印跡(Western blot)檢測蛋白表達

收集好的細胞加入RIPA液提取蛋白,用蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。上樣緩沖液與蛋白樣本混合后98 ℃煮沸5 min后冰浴5 min,蛋白變性后經SDS-PAGE電泳分析,將電泳后蛋白轉移到PVDF膜上,將PVDF膜防置在脫脂牛奶中加入一抗過夜孵育,第2天加入相應二抗常溫孵育1 h,用TBST洗膜,用Image J軟件對條帶量化觀察。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 CCK-8法檢測藁本內酯衍生物對軟骨細胞活力的影響

與空白對照組組比較,IL-1β組細胞活性明顯降低(P<0.01);與IL-1β組比較,藁本內酯衍生物組(0.4、0.2、0.1 μmol/mL)細胞活力顯著升高(P<0.01)。見圖2。

圖2 藁本內酯衍生物對軟骨細胞活力的影響

2.2 免疫熒光檢測COL2α1和ACAN表達

COL2α1和ACAN在細胞核內表達,呈綠色熒光,軟骨細胞胞核被DAPI染成藍色,Merge為藍色、綠色熒光表達的組合比較。空白對照組可見較多的綠色熒光,COL2α1和ACAN在細胞核內高表達,IL-1β組綠色熒光數量明顯減少;與模型組比較,藁本內酯衍生物組綠色熒光數量顯著增加,COL2α1和ACAN高表達,與藁本內酯衍生物濃度呈正相關,見圖3(A、C)。

圖3 藁本內脂衍生物組對軟骨細胞COL2a1、ACAN免疫熒光表達的影響

與空白對照組比較,模型組COL2α1和ACAN的表達明顯降低(P<0.01);與IL-1β組比較,COL2α1表達藁本內酯衍生物組明顯升高(P<0.01),ACAN表達中、高組明顯升高(P<0.01),見圖3(B、D)。

2.3 藁本內酯衍生物對大鼠軟骨細胞PRG4、SOX9、MMP13、ADAMTS5基因表達的影響

與空白對照組比較,IL-1β組PRG4、SOX9 mRNA的表達水平顯著降低,MMP13、ADAMTS5 mRNA的表達水平顯著升高;與IL-1β組相比,藁本內酯衍生物(0.4 μmol/mL、0.2 μmol/mL)組PRG4、SOX9 mRNA表達水平顯著升高(P<0.01),MMP13、ADAMTS5mRNA表達水平顯著降低(P<0.01),且變化與藁本內酯衍生物劑量呈負相關,見圖4。

圖4 藁本內酯衍生物對軟骨細胞PRG4、SOX9、MMP13、ADAMTS5 mRNA表達的影響

2.4 藁本內酯衍生物對炎癥因子HMGB1、COX-2蛋白表達的影響

與空白對照組比較,IL-1β組HMGB1、COX-2的表達水平顯著升高;與IL-1β組相比,藁本內酯衍生物(0.4 μmol/mL)組、藁本內酯衍生物(0.2 μmol/mL)組和藁本內酯衍生物(0.1 μmol/mL)組細胞中HMGB1、COX-2的蛋白表達水平顯著降低,且變化與LIGc呈負相關,見圖5。

2.5 藁本內酯衍生物對TLR4/NF-κB信號通路的影響

與空白對照組比較,IL-1β組TLR4、NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高(P<0.01),與IL-1β比較,藁本內酯衍生物(0.4、0.2、0.1 μmol/mL)組TLR4、NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低(P<0.01);藁本內酯衍生物(0.4、0.2、0.1 μmol/mL)能降低TLR4、NF-κB p65蛋白的表達,表明藁本內酯衍生物能抑制TLR4/NF-κB信號通路激活。見圖6。

圖6 藁本內酯衍生物對軟骨細胞TLR4、NF-κB p65蛋白表達的影響

3 討論

隨著我國人口老齡化社會結構進程導致骨關節炎發病率逐年上升。目前缺乏有效治療藥物,尤其是延緩軟骨退變、增強關節功能同時不良反應小的疾病修飾藥物(DMOAD)[10]。研究發現,中藥及其單體是骨關節炎藥物天然庫,具有研究開發的價值[11]。研究表明,藁本內酯是當歸發揮活血化瘀功效的物質基礎,屬于天然苯酞類化合物[12-13],具有抗炎[14]、抗氧化應激[15]、保護細胞[2],延緩軟骨退變和炎癥治療OA的作用。因此,藁本內酯具有骨關節炎疾病修飾藥物研究價值和潛力。但是,藁本內酯室溫下結構不穩定可脫氫、氧化和降解,不易保存,導致藁本內酯進一步研究和開發研究困難。柳軍璽團隊通過對藁本內酯穩定化目標,進行結構修飾形成常溫下結構穩定的白色晶體化合物,命名為藁本內酯衍生物(LIGc)。Zhang等[9]研究發現藁本內酯衍生物保留了藁本內酯生物活性,而且口服生物利用度顯著升高。高娟[16]研究發現LIGc能夠通過活化BID/NF-κB信號通路治療神經炎性疾病。目前,藁本內酯衍生物對于OA治療作用及機制尚未不明確,本研究通過探討藁本內酯衍生物對IL-1β誘導大鼠軟骨細胞外基質合成與分解代謝的影響,為進一步研究該藥治療OA作用及機制提供理論依據。

軟骨細胞外基質(extracellular matrix,ECM)是OA關節退變的重要病理標記[17]。自身免疫紊亂引起滑膜細胞和巨噬細胞釋放IL-1β等炎癥介質,激活軟骨ECM分解代謝因子,抑制合成代謝因子,導致軟骨ECM降解和軟骨退變[18]。其中,聚集蛋白和膠原蛋白II是維持軟骨ECM功能的主要成分,分解代謝因子導致膠原蛋白II合成不足,從而促進了軟骨ECM降解[19]。SOX9和PRG4是軟骨ECM合成代謝的重要轉錄因子,能促進膠原蛋白II、蛋白聚糖基因轉錄。MMP-13和ADAMTS5是ECM重要的分解代謝因子,激活細胞外基質的分解代謝。本研究也發現,IL-1β即可抑制COL2α1和ACAN蛋白表達(P<0.01),用藁本內酯衍生物(0.4、0.2、0.1 μmol/mL)處理后可促進COL2α1和ACAN蛋白表達(P<0.01)。藁本內酯衍生物能減弱IL-1β對SOX9、PRG4基因表達的抑制作用(P<0.01),同時抑制MMP-13、ADAMTS-5基因表達(P<0.01)。因此,藁本內酯衍生物能抑制軟骨ECM的分解代謝,促進軟骨ECM合成代謝。

骨關節炎是慢性低度免疫炎癥反應性疾病。HMGB1和COX-2是免疫炎癥反應的中心分子,在OA炎癥反應中均發揮著重要的作用,在關節炎的發生和發展過程中具有重要作用[20]。研究發現,HMGB1和COX-2抑制劑在臨床上治療OA疼痛及腫脹療效顯著[21-22]。本研究顯示,IL-1β誘導軟骨細胞中HMGB1和COX-2高表達(P<0.01),而藁本內酯衍生物抑制IL-1β對軟骨細胞中COX-2和HMGB1表達(P<0.01)。結合實驗結果進一步表明藁本內酯衍生物能抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥反應。

TLR4/NF-κB通路是OA免疫炎癥反應的經典通路,IL-1β等炎癥因子激活TLR4/NF-κB信號通路激活炎癥級聯反應,誘導MMP-13、ADAMTS-5等細胞外基質分解代謝因子的表達[23-24]。為了進一步探究藁本內酯衍生物干預IL-1β誘導軟骨細胞外基質分解與合成代謝的可能機制,本研究對TLR4/NF-κB通路相關蛋白進行了檢測。研究結果表明藁本內酯衍生物能顯著抑制軟骨細胞炎癥損傷模型中TLR4、NF-κB p65的蛋白表達(P<0.01)。綜上所述,研究發現藁本內酯衍生物能夠抑制IL-1β所致炎癥因子表達,上調軟骨細胞外基質合成代謝因子、下調分解代謝因子,具有延緩骨關節炎軟骨細胞外基質降解及炎癥治療OA的作用。藁本內酯衍生物作用機制與其調節OA免疫炎癥反應及其相關的TLR4/NF-κB信號通路途徑有關。總之,本研究初步探究藁本內酯衍生物對軟骨大鼠細胞炎癥及細胞外基質降解的作用及可能作用機制,為進一步研究藁本內酯衍生物治療OA奠定理論基礎,但具體作用靶點和機制還需要進一步深入研究探究。