通過MAPK/ERK1/2信號通路探討固本增骨方對MC3T3-E1成骨分化的影響

宋敏 李凱 王凱 范凱 海云翔 李金益 劉路

1.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院,甘肅 蘭州 730000 2.甘肅省中心醫院急診科,甘肅 蘭州 730050

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨轉化增多、骨量降低為特點的慢性骨病,病程發展上伴有骨微結構破壞及骨強度降低等病理改變,導致發生骨折的危險性增加[1]。隨著我國社會人口老齡化的加劇,OP的防治已成為我國面臨的重要公共健康問題。

甘肅省名中醫宋敏教授擅長運用中醫藥防治骨傷科相關疾患,宋教授依據“脾腎虧虛-氣虛血瘀-髓空骨枯”核心病理機制,結合多年臨床經驗總結,從整體觀念、辨證論治理念出發,以益氣健脾、補腎壯骨、活血止痛治則,研發出固本增骨方,在長期臨床治療中療效顯著且具安全性高,前期臨床研究顯示固本增骨方能明顯增加OP患者的骨密度,并通過動物實驗證實其具有雌激素樣作用,可改善卵巢切除OP大鼠雌激素低下狀態,調節骨代謝紊亂,預防骨量丟失[2]。

本研究在團隊前期研究基礎上,通過體外培養MC3T3-E1細胞,觀察固本增骨方含藥血清對成骨細胞增殖分化及礦化的影響并探討其潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物與細胞:SPF級SD大鼠30只,雌雄各半,6周齡,體重為(200±20)g,由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供,實驗動物使用許可證號:SYXK(甘)2020-0009。MC3T3-E1細胞株由賽百慷(上海)生物技術股份有限公司提供(貨號:icell-m031),本實驗通過甘肅中醫藥大學實驗中心動物倫理委員會審查批準(文件批號2021-061)。

1.1.2藥物與試劑:固本增骨方藥物組成:當歸12 g、炙黃芪30 g、熟地黃12 g、燙狗脊12 g、烏藥9 g、黨參12 g、淫羊藿9 g、補骨脂9 g、肉蓯蓉9 g、鹿角膠3 g、土鱉蟲9 g。由甘肅中醫藥大學附屬醫院中藥藥劑科提供,制成藥粉后配成1.13 g/mL混懸液。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(上海詠科生物科技有限公司,批號AS1012);磷酸化蛋白酶抑制劑(賽默飛世爾科技中國有限公司,批號AS1008);茜素紅染液(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號G1038);PD0325901(默克生命科學技術有限公司,批號EP013)。

1.1.3主要實驗儀器:酶標檢測儀(Diatek,DR-200Bs)轉移電泳儀槽(北京市六一儀器廠,SCO6WE);臺式離心機(上海安亭科學儀器廠,TGL-16c);電泳儀(北京市六一儀器廠,DYY-6C);熒光定量PCR儀(Life technologies,QuantStudio 6)。

1.2 方法

1.2.1固本增骨方含藥血清的制備:30只大鼠按照隨機數字表法分為含藥血清組(20只)和空白血清組(10只),固本增骨方制成濃度為1.13 g/mL的混懸液,按照體表面積法換算(10 mL/kg藥液)后對含藥血清組大鼠按2.26 g/kg進行灌胃,空白血清組用等體積生理鹽水灌胃,每日兩次,每次2 mL,連續灌胃7 d,最后一次給藥2 h后,用2%戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉,心臟穿刺采血。

1.2.2細胞培養:MC3T3-E1細胞經復蘇,培養后重懸,將適宜密度細胞接種分瓶后在條件適宜的培養箱中傳代培養。

1.2.3CCK-8檢測細胞增殖活性:取消化重懸的MC3T3-E1細胞,以1.5×105個/mL接種于96孔板,共設立6組,每孔加100 μL,每組平行設置6個復孔,分為空白血清組、5%、10%、15%、20%、25%各含藥血清組,空白血清組加入空白血清培養基200 μL,其余各組加入200 μL含有相應濃度固本增骨方含藥血清的培養基。在對應24、48、72 h干預時間點向每孔加入10 μL CCK-8溶液,培養箱中孵育2 h,酶標儀測定450 nm波長處的吸光度值。

1.2.4細胞ALP活性檢測:將MC3T3-E1細胞制成單細胞懸液,以1.5×105個/mL密度接種細胞,按上述分組加入相應培養基,每3 d換液1次,誘導7 d后收集各組細胞培養液,2000g×10 min離心,去不溶物,取上清作為樣品進行ALP活力檢測,酶標儀檢測波長設置為520 nm。

1.2.5茜素紅染色:選取MC3T3-E1細胞,以2×105個/孔的密度于6孔板,細胞分組同上,根據各組條件干預培養14 d后進行茜素紅染色。具體步驟為吸去各組相應培養基,用PBS沖洗3次,每次5 min,加入2 mL 4%多聚甲醛固定20 min,再用PBS沖洗3次,每次5 min,加入茜素紅染液,染色5～10 min,PBS沖洗3次。在倒置顯微鏡下觀察茜素紅染色效果并拍照存檔。

1.2.6RT-PCR檢測ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA表達:根據CCK-8、ALP活性檢測及茜素紅染色結果綜合分析,將MC3T3-E1細胞分為A、B、C、D 4組。A組:空白血清組,B組:20%含藥血清組,C組:空白血清+PD0325901組,D組:20%含藥血清+PD0325901組,各組加入相應血清及PD0325901繼續培養14 d,采用trizol法提取總RNA,核酸蛋白儀檢測總RNA的濃度及純度,按照說明書逆轉錄步驟得到cDNA。設計引物及反應體系。后在RT-PCR儀上進行反應后檢測目的基因CT值。

1.2.7Western blot檢測ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白表達:4組細胞按相應條件干預培養36 h后棄掉培養基,用PBS沖洗后每孔加入裂解液,置于冰上裂解細胞30 min后提取細胞總蛋白,蛋白變性后,采用BCA法進行蛋白定量,后進行電泳、轉膜及封閉,先后加入一抗和二抗,將配置好發光液,均勻滴加發光液于膜中,顯影,成像,分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析法,組間兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 固本增骨方含藥血清對MC3T3-E1細胞增殖活性的影響

CCK-8實驗結果顯示,與空白對照組相比,10%、15%、20%、25%含藥血清組在24、48、72 h時的OD值差異具有統計學意義(P<0.05),且以20%含藥血清組在48 h時間點的OD值最高。干預至48 h后,細胞增殖呈下降趨勢,48 h時間點MC3T3-E1細胞增殖活性與24、72 h各時間點進行比較,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度固本增骨方含藥血清對各組細胞增殖的影響

2.2 固本增骨方含藥血清對MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶活性的影響

與空白對照組相比,10%、15%、20%、25%含藥血清組ALP活性明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與各含藥血清組相比,20%含藥血清組ALP活性升高更加顯著,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組MC3T3-E1細胞干預7 d后細胞ALP的活性比較

2.3 固本增骨方含藥血清對MC3T3-E1細胞成骨礦化的影響

藥物干預14 d后茜素紅染色,鏡下觀察可見,與空白對照組組間對比,各含藥血清組(10%、15%、20%、25%)紅色鈣結節數量明顯更為密集,5%含藥血清組紅色鈣結節數量無明顯差異,其中20%含藥血清組紅色鈣結節密集程度最為顯著,當濃度增加到25%時,鈣結節密集程度略呈下降趨勢,見圖1。

圖1 各組MC3T3-E1細胞茜素紅染色結果(×200)

2.4 各組細胞ERK1/2、Runx2、BMP-2的mRNA表達

與A組相比,B組ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA的表達顯著升高,差異具有統計學意義(P<0.05);使用抑制劑后,相比于A組、B組,C組及D組上述目的基因表達水平明顯降低(P<0.05),與D組相比,C組的下降趨勢更為顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組MC3T3-E1細胞中ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA表達量

2.5 各組細胞ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2的蛋白表達

與A組相比,B組ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白表達水平明顯升高,差異顯著(P<0.05)。相比D組,B組ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2表達水平升高(P<0.05)。A組與C組相比,結果無明顯差異(P>0.05)。與D組相比,C組ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2表達水平較低(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 各組細胞目的蛋白P-ERK1/2、ERK1/2、Runx2、BMP-2的表達量

表4 各組細胞目的蛋白ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2的表達量

3 討論

骨質疏松癥作為一種系統代謝性疾病,在病程發展及轉歸預后上嚴重影響老年人的生活質量[3]。中醫學將OP歸屬為“骨痿”范疇[4],《素問·痿論》曰:“腎氣熱,則腰膝不舉,骨枯而髓減,發為骨痿”,原文首次闡明了“腎氣熱”是OP發生的致病因素,“髓減骨枯”是OP發展的核心病機。又有《脾胃論·脾胃勝衰論》曰:“脾病則下流乘腎……是為骨蝕”,將脾病亦作為OP發生發展的重要環節[5]。由此可見,脾虛乏源損及腎,脾腎不足,則骨削肉減,發為骨痿。OP為老年慢性骨病,發病緩慢,病程較久,久病則生瘀滯,正如《靈樞·營衛生會》云:“老者之氣血衰,其肌肉枯,氣道澀[6]。”因此,氣虛血瘀是OP發生發展的關鍵促進因素。由上述可知,OP的發生發展是多因素共同作用的結果,而中醫藥防治疾病立足于“整體觀念、辨證論治”體系,具有多途徑、多靶點、多層面等突出特點,在OP的防治中可發揮其綜合治療優勢。固本增骨方由黃芪、黨參、熟地黃、淫羊藿、肉蓯蓉、當歸等藥組成,全方溫、補、通、調并用,共奏補腎壯骨、益氣健脾、活血止痛之效,能夠有效增加患者骨密度,同時改善其臨床癥狀,具有良好的臨床療效。前期網絡藥理學研究提示[7],固本增骨方發揮抗OP作用與多種入血活性分子的交感、聯合效應有關,這一過程涉及多條信號通路的調控。

MAPK作為一類介導細胞反應的蛋白激酶家族廣泛存在于真核生物細胞內,活化的MAPK參與細胞增殖、分化、應激及炎癥反應等過程[8]。ERK1/2是MAPK通路的主要亞型之一,其通過依次激活MAPKKK-MAPKK-MAPK三級激酶模式實現信號由細胞膜外向核內的傳遞,活化的MAPK/ERK1/2通路廣泛參與調控成骨細胞的增殖與分化,從而發揮防治OP的作用[9]。研究發現,淫羊藿苷可通過調控MAPK/ERK1/2的磷酸化抑制OC分化,從而達到防治OP的作用[10]。陳錦成等[11]研究發現,龜鹿二仙膠含藥血清可通過激活MAPK/ERK1/2通路及該通路下游靶蛋白E26轉錄因子1促進大鼠BMSCs成骨分化。丁道芳等[12]研究了不同濃度大鼠含藥血清對成骨細胞增殖的影響,發現激活MAPK-ERK1/2通路可提高成骨基因Ⅰ型膠原、Runx2和ALP的表達水平,有助于提高成骨細胞的增殖活性。

本研究結果顯示,固本增骨方對MC3T3-E1細胞增殖活性具有促進作用,其中,20%含藥血清干預48 h對MC3T3-E1細胞的增殖作用最為顯著,當含藥血清濃度增加到25%時,MC3T3-E1細胞生長速度呈現下降趨勢,這可能與細胞間接觸性抑制作用有關。ALP活性檢測與茜素紅染色實驗也印證了這一結果,檢測各組培養液中ALP活性表達水平,結果表明,在一定含藥血清濃度范圍(10%～20%),ALP活性增長呈現濃度依賴性,其中,以20%含藥血清組ALP活性最為顯著。當濃度增加到25%時,ALP活性降低。茜素紅染色后,20%含藥血清組鈣結節數量最為密集。為了驗證固本增骨方促MC3T3-E1細胞成骨分化作用與MAPK/ERK1/2信號通路的關系,進一步檢測了MAPK/ERK1/2信號通路相關蛋白基因。WB及RT-PCR結果表明,與空白對照組相比,固本增骨方含藥血清能夠顯著上調P-ERK1/2、ERK1/2、BMP-2、Runx2蛋白及ERK1/2、BMP-2、Runx2 mRNA的表達水平。加入PD0325901通路抑制劑后,空白血清組與含藥血清組中目的蛋白及mRNA表達均下調,但含藥血清組目的蛋白及mRNA的表達水平仍高于空白血清組,表明固本增骨方含藥血清具有促進MC3T3-E1細胞的成骨分化的作用,其作用機制可能與激活MAPK/ERK1/2信號通路,上調成骨相關因子Runx2、BMP-2有關。然而,由于中藥復方具有多層面、多途徑的綜合治療機理,當前對固本增骨方防治OP的研究仍處于中藥復方的整體調控作用,其中發揮作用的具體有效成分及潛在分子靶點尚不明確。此外,研究發現除ERK1/2通路外,p38與JNK通路同樣作為MAPK的主要亞型對于骨穩態的調控也具有一定作用[13-14],而對于ERK1/2與JNK及p38各通路之間是否存在交互調控作用尚不清楚,有待進一步研究。