Sirt6與狼瘡性腎炎足細胞損傷的關系

魏玉嬌,陳超,周燕,劉南池,馬瑞霞

(青島大學附屬醫院,山東 青島 266003 1 腎病科; 2 心血管內科)

狼瘡性腎炎(LN)是系統性紅斑狼瘡(SLE)病人最常見及最嚴重的并發癥之一,是影響SLE病人預后的主要因素[1]。LN以蛋白尿、鏡下血尿、進行性腎功能損害為主要特點,其中蛋白尿是LN的主要臨床表現,是判斷疾病活動性的重要指標[2]。足細胞是腎小球濾過膜的重要組成部分,對維持腎功能具有重要作用。研究發現,足細胞損傷是LN病人蛋白尿的發病機制之一[3],其損傷程度是終末期腎病的主要預后決定因素[4]。LN病人足細胞損傷的機制仍不清楚,可能與免疫復合物沉積、補體激活、炎癥反應、細胞凋亡及自噬有關[5]。Sirtuins是一類進化保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性組蛋白脫乙酰化酶[6],哺乳動物Sirtuins蛋白家族共包括7個成員(Sirt1～7)。沉默調節蛋白6(Sirt6)是Sirtuins蛋白家族中較為重要的一員,主要通過去乙酰化H3K9、H3K59抑制炎癥反應及細胞凋亡、促進DNA修復、調節葡萄糖穩態,參與多種疾病的發生發展過程[7]。有研究發現,Sirt6在糖尿病腎病(DN)中表達降低,而誘導Sirt6高表達可通過激活AMPK途徑維持足細胞線粒體穩態、減少足細胞凋亡,發揮腎臟保護作用[8]。目前國內外有關Sirt6在LN中的作用研究甚少。本研究擬探討Sirt6與LN病人足細胞損傷的關系及相關機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入研究對象為2018年1月—2020年1月于我院腎病科住院治療、診斷明確的LN病人70例,平均年齡(31.72±7.92)歲。納入標準:①符合2012年系統性紅斑狼瘡國際臨床協作組(SLICC)制定的SLE診斷標準[9],伴有腎臟損害的臨床表現(蛋白尿、血尿或腎功能不全);②年齡>18周歲;③初治且經腎臟穿刺活檢病理確診為LN;④所有病人均有完整的病史、實驗室檢查資料,且女性病人均未在妊娠期。所有病人均排除腎小球或腎間質性腎炎等原發和繼發性腎臟疾病。根據SLE疾病活動度評分(SLEDAI評分)[10]分為活動組(≥7分)47例、非活動組(≤7分)23例。同時選擇性別、年齡相匹配的因腎外傷行腎臟切除的病人(腎臟組織光鏡檢查證實為正常腎組織)15例作為對照組。本研究經青島大學附屬醫院倫理委員會審核批準,且全部納入對象均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集

收集研究對象的臨床資料及實驗室檢查結果,實驗室檢查結果包括24 h尿蛋白定量(24hUP)、血紅蛋白(HB)、血小板(PLT)、血清清蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、膽固醇(CH)、三酰甘油(TG)、C反應蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)、補體C3(C3)、補體C4(C4)、抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA)、抗核抗體(ANA)以及腎小球濾過率估計值(eGFR,CKD-EPI法計算)。

1.3 腎臟病理檢查

病人于B超引導下行腎穿刺活檢術,腎組織活檢標本制成3 μm厚的石蠟包埋切片,常規行HE染色,光鏡觀察腎組織結構,電鏡觀察腎小球足細胞。LN腎臟病理分型根據2012年SLICC診斷標準[1]。病理分型采用2003年國際腎臟病協會和腎臟病理學會(ISN/RPS)標準[11]。

1.4 免疫組化染色方法檢測Nephrin、Sirt6表達

腎組織活檢標本石蠟包埋、切片,使用二甲苯、不同濃度梯度的乙醇溶液進行脫蠟、水化,內源性過氧化物酶封閉抗原。洗滌后分別加入單克隆兔抗人Nephrin抗體(1∶1 000,ab216341,Abcam,Cambridge,MA,USA)、Sirt6抗體(1∶1 000,ab62739,Abcam,Cambridge,MA,USA),洗滌后37 ℃下加入山羊抗兔IgG抗體(1∶200,PV9001,北京中杉金橋公司)孵育30 min,蘇木精復染、風干,二甲苯脫色后封片,顯微鏡下觀察。Nephrin、Sirt6陽性染色均為棕色。每張切片選取10個視野,使用IPP軟件(Insilicos,Seattle,WA,USA)分別計算腎組織中Nephrin、Sirt6的陽性染色面積,取其平均值。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 各組病人臨床資料比較

與對照組比較,LN非活動組病人HB、PLT、ALB、C3、C4明顯降低, 24hUP、ESR、CRP升高,差異有統計學意義(F=7.64～120.60,P<0.05),CH、TG、Scr、BUN差異無統計學意義(P>0.05);與LN非活動組相比,LN活動組病人HB、ALB、C3、C4、eGFR明顯降低,而24hUP、SCr、BUN、CH、ESR明顯升高,差異有統計學意義(F=6.17～120.60,P<0.05)。見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2 各組腎組織光鏡、電鏡觀察結果比較

HE染色光鏡觀察顯示,LN病人腎小球體積增大,系膜區增寬,系膜細胞及系膜基質增多,且活動組變化更明顯(圖1)。電鏡觀察顯示,對照組腎小球足突完整、排列規則,基底膜連續;LN組腎小球系膜細胞、系膜基質明顯增生,基底膜不均勻增厚,足突彌漫融合甚至消失,且活動組變化更明顯(圖2)。

A:對照組;B:LN非活動組:C:LN活動組。HE染色,放大200倍。

2.3 各組足細胞Nephrin表達水平比較

免疫組化染色顯示,對照組足細胞Nephrin表達明顯,呈連續、線性分布;LN組足細胞Nephrin表達降低,分布不均,且LN活動組較非活動組降低更明顯,差異有統計學意義(F=133.61,P<0.05)。見圖3、表2。

A:對照組;B:LN非活動組:C:LN活動組。放大400倍。

表2 各組Nephrin及Sirt6表達比較

2.4 腎組織Sirt6表達水平比較

免疫組化染色顯示,對照組Sirt6均勻分布在腎小球、腎小管及腎間質中,且主要分布在腎小球細胞核中;LN組Sirt6表達降低,分布不均,且LN活動組較非活動組降低更明顯,差異有統計學意義(F=103.65,P<0.05)。見圖4、表2。

A:對照組;B:LN非活動組:C:LN活動組。放大400倍。

2.5 腎組織Sirt6表達與24hUP、ESR、C3、ALB等臨床指標的相關性

Spearman相關性分析顯示,腎組織中Sirt6表達水平與24hUP(r=-0.580,P<0.01)、ESR(r=-0.559,P<0.01)呈負相關,與C3(r=0.670,P<0.01)、ALB(r=0.660,P<0.01)呈正相關。見圖5。

圖5 Sirt6與臨床指標的相關性散點圖

2.6 腎組織Sirt6表達與足細胞Nephrin表達及SLEDAI評分的相關性

Spearman相關性分析顯示,腎組織Sirt6表達與足細胞Nephrin表達呈顯著正相關(r=0.954,P<0.01),而與SLEDAI評分呈顯著負相關(r=-0.666,P<0.01)。見圖6。

圖6 腎組織Sirt6與足細胞Nephrin及疾病活動性的相關性散點圖

3 討 論

SLE是一種伴有全身多器官損害的自身免疫性疾病,以血清中出現抗核抗體(ANA)等多種自身抗體為主要特征[11]。LN是SLE最常見的器官損害之一,是判斷疾病進展及預后的重要指標。LN的發病機制尚不清楚,迄今為止,越來越多的研究強調足細胞損傷在LN發病中具有重要作用[12]。足細胞是高度分化的細胞,位于鮑曼囊內側,包裹著腎小球毛細血管。足細胞通過表達突觸素、Nephrin、Podocin和Wilms腫瘤蛋白等標志物,在維持腎小球濾過屏障完整性及維持腎功能方面發揮重要作用[13]。本研究光鏡、電鏡觀察發現,LN病人腎小球基底膜增厚,系膜細胞及系膜基質增生,足突彌漫融合甚至消失;免疫組化染色顯示,足細胞Nephrin表達降低,且活動組降低更明顯,提示LN病人存在足細胞損傷。本文結果還顯示,Nephrin表達水平與24hUP負相關,提示Nephrin可能與疾病活動性有關。LN足細胞損傷的具體機制尚未明確,可能與免疫復合物沉積、補體激活、淋巴細胞浸潤、細胞凋亡及自噬有關[5,14]。有研究發現,Sirtuins蛋白家族廣泛參與足細胞穩態及腎功能的維持[15]。

Sirt6是Sirtuins蛋白家族中最為重要的一員,其在雄性小鼠中過表達可增加小鼠壽命,是目前公認的“長壽蛋白”[16]。Sirt6位于人類19號染色體13.3端,有兩個異構體,分別由8個外顯子和7個外顯子編碼355和328個氨基酸長度的蛋白。Sirt6蛋白結構由高度保守的核心催化區、N端組蛋白去乙酰化酶功能區及C端核定位信號組成。Sirt6的空間結構包含1個由氫鍵連接的鋅指蛋白結合域及Rossman折疊區共同維持Sirt6空間構象的穩定性[17]。Sirt6可以通過抑制腎臟炎癥、纖維化、促進自噬參與足細胞的穩態和腎功能的維持[9,18]。最近研究發現,Sirt6參與DN的發生及發展過程[8,15,19],但其在LN中的作用尚不清楚。本研究發現,Sirt6陽性染色均勻分布在腎小球、腎小管及腎間質中,且主要分布在腎小球細胞核中,與LIU等[20]研究結果相一致。推測腎組織Sirt6可能在細胞核和細胞漿中穿梭,其定位主要取決于細胞類型或環境因素。

本文研究結果顯示,與對照組相比,LN病人腎組織Sirt6表達降低,且LN活動組較非活動組降低更明顯;Sirt6表達水平與足細胞Nephrin表達呈正相關,而且Sirt6表達水平與24hUP、SLEDAI評分、ESR明顯負相關,與ALB、C3正相關。提示Sirt6參與LN足細胞的損傷,其表達水平可能與疾病活動性有關。既往研究發現,Sirt6通過去乙酰化組蛋白H3K9抑制Notch1、Notch4信號轉錄,發揮抗炎、抗凋亡及促進自噬的作用保護足細胞[20]。還有研究指出,Sirt6通過上調Bcl-2和CD206的表達、降低Bax和CD86的表達,激活巨噬細胞向M2型轉化,保護足細胞免受高糖誘導的損傷[21]。因此猜測,Sirt6在LN中也可能通過調節巨噬細胞表型的轉化參與足細胞的損傷。今后將擴大樣本量,進行體內外實驗及動物實驗進一步探討Sirt6在LN病人足細胞損傷中的具體作用。

綜上所述,LN病人腎組織Sirt6的表達明顯降低,且與足細胞Nephrin表達正相關,與疾病活動性負相關。Sirt6在LN足細胞損傷中的發病機制仍需進一步探討。