白藜蘆醇對ox-LDL誘導的內皮細胞鐵死亡影響

游福蓉 杜占慧 宗麗娟 王勤拯 張成 邢泉生

［收稿日期］2023-03-07;? ［修訂日期］2023-07-17

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（82071583）

［第一作者］游福蓉（1996-），女，碩士研究生。E-mail：157306-88277@163.com。

［通信作者］張成（1967-），男，副主任醫(yī)師。E-mail：15805321-977@163.com。邢泉生（1964-），男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導師。E-mail：qsxing@163.com。

［摘要］? 目的

探討白藜蘆醇對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）鐵死亡的影響。

方法? 利用ox-LDL誘導建立HUVECs鐵死亡模型。實驗設置對照組、ox-LDL組和白藜蘆醇低、中、高劑量組。分別檢測各組細胞存活率及細胞中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、亞鐵離子（Fe2+）、活性氧（ROS）水平；采用免疫印跡法及免疫熒光法檢測細胞中谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、溶質載體家族7成員11（SLC7A11）和鐵蛋白重鏈（FTH1）蛋白表達。

結果? 與對照組相比，ox-LDL組細胞存活率及細胞中GSH、GPX4、SLC7A11和FTH1表達明顯降低，MDA、Fe2+和ROS水平顯著升高；與ox-LDL組相比，白藜蘆醇低、中、高劑量組細胞存活率及細胞中GSH、GPX4、SLC7A11和FTH1表達明顯升高，MDA、Fe2+和ROS水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（F=9.93～722.16，P<0.05）。

結論? 白藜蘆醇可能通過激活SLC7A11/GPX4信號通路保護HUVECs免受鐵死亡的影響。

［關鍵詞］? 白藜蘆醇；人臍靜脈內皮細胞；鐵死亡

［中圖分類號］? R329.2;R972.7

［文獻標志碼］? A

［文章編號］? 2096-5532（2023）05-0633-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.144

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡出版］? https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20231114.1021.001;2023-11-15? 10：23：50

INFLUENCE OF RESVERATROL ON OX-LDL-INDUCED FERROPTOSIS IN HUMAN UMBILICAL VEIN ENDOTHELIAL CELLS

YOU Furong， DU Zhanhui， ZONG Lijuan， WANG Qinzheng， ZHANG Cheng， XING Quansheng

＼ （Heart Center， The Affi-

liated Women and Childrens Hospital of Qingdao University， Qingdao 266034， China）

＼; ［ABSTRACT］＼ Objective＼ To investigate the influence of resveratrol on oxidized low-density lipoprotein （ox-LDL）-induced ferroptosis in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）.

＼ Methods＼ The ferroptosis in HUVECs was induced by ox-LDL. In this study， control group， ox-LDL group， and low-， middle-， and high-dose resveratrol groups were set. Cell viability and levels of malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH）， ferrous ion （Fe2+）， and reactive oxygen species （ROS） in cells were measured. Western blot and immunofluorescence method were applied to measure the protein expression of glutathione peroxidase 4 （GPX4）， solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11）， and ferritin heavy chain 1 （FTH1） in cells.

＼ Results＼ Compared with the control group， the ox-LDL group had significantly decreased cell viability and expression levels of GSH， GPX4， SLC7A11， and FTH1， and significantly increased MDA， Fe2+， and ROS levels. Compared with the ox-LDL group， the low-， middle-， and high-dose resveratrol groups had significantly increased cell viability and expression levels of GSH， GPX4， SLC7A11， and FTH1， and significantly decreased MDA， Fe2+， and ROS levels （F=9.93-722.16，P<0.05）.

＼ Conclusion＼ Resveratrol may protect HUVECs from ferroptosis by activating the SLC7A11/GPX4 signaling pathway.

［KEY WORDS］＼ resveratrol; human umbilical vein endothelial cells; ferroptosis

動脈粥樣硬化（AS）是以脂質蓄積和炎癥細胞浸潤為主要特征的慢性炎癥性過程，是冠心病、心肌梗死、腦卒中等眾多心腦血管事件的病理基礎[1-3]。AS發(fā)病機制復雜，與多種因素密切相關，其中內皮細胞功能障礙是AS發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)[4]。內皮細胞功能障礙有利于氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）浸潤至內皮下層，同時選擇性招募單核細胞進入內皮下層轉變?yōu)榫奘杉毎ㄟ^吞噬經(jīng)理化修飾的脂蛋白形成泡沫細胞引發(fā)局部炎癥反應，從而誘導AS的發(fā)生發(fā)展[3，5]。鐵死亡是近年發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴的新型細胞死亡方式，其特征是鐵依賴的活性氧（ROS）和脂質過氧化物的蓄積、谷胱甘肽（GSH）的耗竭以及谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的失活等[1-2]。

多項研究結果表明，鐵死亡是內皮細胞功能障礙的重要原因，在推動AS進展中發(fā)揮了重要作用[3-4]。白藜蘆醇為一種天然植物多酚，主要存在于葡萄、花生、虎杖、大豆等多種植物中，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、延緩衰老等功效[6-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過調節(jié)血脂水平、抗血小板聚集、抗炎、抑制低密度脂蛋白氧化修飾、抑制斑塊內新生血管等作用發(fā)揮抗AS作用[8-10]。但有關白藜蘆醇對血管內皮細胞鐵死亡的影響尚未見報道。因此，本研究利用鐵死亡誘導劑ox-LDL建立人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）鐵死亡模型，探討白藜蘆醇對血管內皮細胞鐵死亡的影響及機制，從而為明確中醫(yī)藥治療AS疾病作用機制提供新的科學依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 主要材料

HUVECs購自武漢普諾賽生命科技有限公司；內皮細胞培養(yǎng)液購自美國Sciencell公司；ox-LDL購自美國默克公司；白藜蘆醇，分子式為C14H12O3，分子量228.24，純度99.94%，購自美國MedChemExpress公司；ROS檢測試劑盒購自中國白鯊生物有限公司；亞鐵離子（Fe2+）檢測試劑盒購自中國賽默飛世爾公司；GSH及丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；CCK-8溶液購自武漢Proteintech公司；兔抗GPX4以及鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗鐵蛋白重鏈（FTH1）單克隆抗體購自Abmart公司；兔抗溶質載體家族7成員11（SLC7A11）單克隆抗體、山羊抗兔lgG-HRP及山羊抗鼠lgG-HRP二抗購自美國Proteintech公司。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 細胞培養(yǎng)及分組? HUVECs置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中，用內皮細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。將正常的HUVECs隨機分為對照組（A組）、ox-LDL組（B組）及白藜蘆醇低、中、高劑量組（C、D、E組）。A組在正常生長條件下培養(yǎng)，B組加入含有100 mg/L ox-LDL的內皮細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，C、D、E組分別用白藜蘆醇5、10、20 μmol/L預處理4 h后，更換為含有100 mg/L ox-LDL的內皮細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.2.2? CCK-8法檢測細胞存活率? 取對數(shù)生長期HUVECs，以每孔5 000個接種于96孔板中，待細胞貼壁、按照實驗分組加入相應藥物處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，應用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔的光密度（OD）值。然后計算細胞存活率，細胞存活率=[（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）]×100%。每組設4個復孔，實驗獨立重復3次。

1.2.3? 細胞中Fe2+、ROS、MDA和GSH含量檢測

將HUVECs按每孔2×105個接種于6孔板內，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照實驗分組加入相應藥物進行處理。收集各組細胞，使用Fe2+、ROS、GSH、MDA檢測試劑盒測定細胞內Fe2+、ROS、GSH、MDA含量，實驗步驟嚴格按照說明書進行。每組設3個復孔，實驗獨立重復3次。

1.2.4? 免疫印跡法檢測細胞內GPX4、SLC7A11和FTH1蛋白表達? 將HUVECs接種于6孔板，按照實驗分組加入相應藥物處理。收集各組細胞并提取總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳反應后，轉膜、封閉，加入一抗（β-actin、GPX4、FTH1和SLC7A11，以1∶1 000抗體稀釋液稀釋）4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗（以1∶5 000抗體稀釋液稀釋）和羊抗鼠二抗（以1∶10 000抗體稀釋液稀釋）室溫孵育1 h，洗去二抗，用ECL試劑盒顯色，在凝膠成像儀上顯影并拍照，用Image J軟件分析條帶灰度值。結果以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示。實驗獨立重復3次。

1.2.5? 免疫熒光法檢測細胞內GPX4、SLC7A11和FTH1表達? 將HUVECs按每孔2×103個接種于24孔板內，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按實驗分組加入相應藥物處理。用40 g/L多聚甲醛室溫固定15 min，PBS浸洗，5 g/L Triton X-100透膜15 min，50 g/L BSA封閉1 h，去除封閉液，加入GPX4（應用1∶200抗體稀釋液稀釋）、SLC7A11（應用1∶200抗體稀釋液稀釋）以及FTH1（以1∶100抗體稀釋液稀釋）一抗4 ℃孵育過夜。用PBS洗凈一抗后，加入熒光標記的羊抗兔二抗（以1∶200抗體稀釋液稀釋）室溫避光孵育1 h。用PBS洗凈二抗后，以DAPI染核10 min，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。應用Image J軟件分析記錄每張圖片的平均熒光強度。實驗獨立重復3次。

1.3? 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結? 果

2.1? ox-LDL和白藜蘆醇對HUVECs存活率影響

CCK-8實驗結果顯示，ox-LDL濃度為50、100、150、200 mg/L逐漸升高時，HUVECs存活率逐漸降低。當ox-LDL濃度為100 mg/L時，與對照相比，細胞存活率為54.30%，差異具有統(tǒng)計學意義（F=655.08，P<0.01）。因此，為保證有足夠活力的細胞進行后續(xù)實驗，本研究選擇100 mg/L ox-LDL干預24 h作為誘導細胞鐵死亡的條件。見圖1。與對照相比，5、10、20 μmol/L濃度的白藜蘆醇對細胞存活率無明顯影響（P＞0.05），說明本實驗中所用不同劑量的白藜蘆醇對HUVECs無損傷作用。見圖2。

2.2? 白藜蘆醇對ox-LDL誘導的HUVECs存活率的影響

CCK-8實驗結果顯示，各組HUVECs存活率差異具有統(tǒng)計學意義（F=200.00，P<0.01）。B組細胞存活率較A組顯著降低（P<0.01）；而經(jīng)低、中、高劑量白藜蘆醇預處理可減輕ox-LDL誘導的HUVECs損傷，并呈劑量依賴性，與B組比較，C、D、E組細胞存活率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖3。

2.3? 白藜蘆醇對ox-LDL誘導HUVECs中ROS、MDA、GSH和Fe2+含量的影響

各組HUVECs中ROS、MDA、GSH和Fe2+含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F=30.26～415.07，P<0.05）。與A組相比，B組HUVECs中ROS、MDA和Fe2+含量顯著增加，而GSH含量顯著降低（P<0.05）；與B組相比較，C、D、E組HUVECs中ROS、MDA和Fe2+含量顯著降低，GSH含量顯著升高（P<0.05）。見表1。

2.4? 白藜蘆醇對ox-LDL誘導HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達的影響

免疫印跡法檢測結果顯示，各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（F=58.62～88.92，P<0.05）。與A組相比較，B組HUVECs中GPX4、FTH1以及SLC7A11蛋白的表達顯著降低（P<0.05）；與B組相比較，C、D、E組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白的表達顯著增加（P<0.05）。見圖4和表2。

免疫熒光法檢測結果顯示，各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F=62.18～722.16，P<0.05）。與A組相比，B組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達顯著降低（P<0.05）；與B組相比，E組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達顯著增加（P<0.05）。見圖5和表3。

A、B、C分別示A組、B組和E組GPX4的表達，綠色為GPX4染色，藍色為DAPI熒光染色下的細胞核；D、E、F分別示A組、B組和E組FTH1的表達，綠色為FTH1染色，藍色為DAPI熒光染色下的細胞核；G、H、I分別示A組、B組和E組SLC7A11的表達，綠色為SLC7A11染色，藍色為DAPI熒光染色下的細胞核。白色箭頭示目的蛋白表達區(qū)域。免疫熒光染色，100倍。

3? 討? 論

隨著社會老齡化加重及居民不健康生活方式增加，我國AS誘發(fā)的多種心血管疾病發(fā)病率、死亡率持續(xù)升高。AS發(fā)病機制復雜，主要與內皮細胞功能障礙、炎癥反應、氧化應激、血栓形成及脂質浸潤等密切相關[1-3]。目前逆轉AS嚴重后果的療法仍然有限。白藜蘆醇作為多酚類植物化合物的代表，可以通過調節(jié)脂質代謝、抑制ROS生成、維持內皮功能穩(wěn)定等來發(fā)揮抗AS作用。但白藜蘆醇的具體作用機制至今尚未完全闡明。因此，本研究從鐵死亡的角度來探討白藜蘆醇對AS的作用及其潛在機制。有研究表明，血管內皮細胞用ox-LDL處理后表現(xiàn)出鐵死亡的特征，使用鐵死亡抑制劑則明顯逆轉了細胞的死亡[11]。因此，本研究使用ox-LDL誘導HUVECs發(fā)生鐵死亡。本文結果顯示，ox-LDL處理后內皮細胞活力明顯下降，出現(xiàn)鐵死亡；經(jīng)白藜蘆醇（5、10、20 μmol/L）預處理可以降低細胞鐵死亡，減少ROS和MDA產(chǎn)生，顯著提高內皮細胞活力，且該效應隨著白藜蘆醇劑量增加而增強。這表明白藜蘆醇對ox-LDL誘導的鐵死亡有拮抗作用，從而可以延緩AS病程進展。

內皮細胞損傷是AS早期病理改變。有研究表明，鐵死亡通過多種生理機制參與AS的內皮細胞損傷，如鐵過載可以促進ROS產(chǎn)生并且激活局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)，誘導血管內皮細胞中氧化應激水平升高，導致內皮損傷，增加AS斑塊的不穩(wěn)定性[12]；鐵死亡抑制劑通過減輕鐵死亡引起的內皮細胞氧化損傷而發(fā)揮抗AS作用[3]。由此可見，鐵死亡已成為調節(jié)內皮細胞功能的關鍵角色。

鐵死亡是一種鐵依賴的可調節(jié)的氧化性細胞死亡方式[13]，在生物化學方面表現(xiàn)為細胞內抗氧化系統(tǒng)GSH/GPX4失活，過量的Fe2+通過芬頓反應產(chǎn)生大量的ROS，與細胞膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化應激反應，導致脂質過氧化物積累，使MDA生成增多。本研究經(jīng)ox-LDL處理的HUVECs中，F(xiàn)e2+、ROS和MDA含量增加，F(xiàn)TH1和GSH水平下降；而白藜蘆醇干預可降低細胞內Fe2+、ROS和MDA含量，提高FTH1和GSH的水平。MDA是ROS介導脂質過氧化生成的一種不飽和醛類物質，由于它與親核化合物的反應性以及在沒有活性的情況下，能使蛋白質和DNA發(fā)生反應，生成特殊的加合物而產(chǎn)生細胞毒性[14]。相關研究表明，MDA可以促進巨噬細胞產(chǎn)生炎癥因子，從而加重血管周圍的炎癥反應并損傷血管內皮細胞，破壞內皮結構完整性并造成內皮功能障礙，促進AS的發(fā)生[15]。因此，MDA被認為是造成血管功能障礙的介質之一。GSH是體內的非酶抗氧化劑，可以作為硒依賴性GPX4的輔因子和底物來減少脂質過氧化物，在降低氧化應激水平中起著關鍵作用[16-19]。由此可見，白藜蘆醇通過提高HUVECs抗氧化能力和降低MDA含量來減輕ox-LDL誘導產(chǎn)生的細胞損傷。鐵蛋白為細胞提供了一種以氧化還原非活性形式鎖住過量鐵的手段，以防止鐵介導的細胞和組織損傷。鐵蛋白由鐵蛋白輕鏈和FTH1構成，是一種儲鐵蛋白復合體，可調控儲存的鐵離子。FTH1在鐵蛋白結構中起到關鍵作用，也是鐵死亡發(fā)生的標志性蛋白，可催化Fe2+氧化發(fā)揮儲鐵功能進而減少細胞內Fe2+。FTH1水平降低導致體內Fe2+水平升高，過量的Fe2+會引起脂質代謝紊亂，導致ROS水平升高，促進鐵死亡發(fā)生[18，20]。本研究結果表明，白藜蘆醇能夠通過調節(jié)氧化應激清除過量的Fe2+，抑制鐵死亡的發(fā)生。

GPX4作為細胞內唯一可直接降低磷脂過氧化的抗氧化酶，是鐵死亡的重要調節(jié)因子[21]。GPX4以GSH為還原劑，催化過氧化物的過氧鍵轉變?yōu)榱u基，將過氧化物轉變?yōu)轭愔迹蛊涫パ趸钚裕M而抑制鐵死亡[16，22]。GSH和GXP4被認為是細胞發(fā)生鐵死亡的標志物[23-24]。本研究結果顯示，ox-LDL組HUVECs存活率降低，GSH含量降低，GPX4蛋白的表達下調；給予白藜蘆醇預處理后，細胞存活率升高，GSH含量升高，GPX4蛋白表達上調，提示白藜蘆醇可以減輕HUVECs鐵死亡。

SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸交換轉運體（System Xc-）的底物特異性亞基，在抗氧化劑GSH的生物合成中起著核心作用。SLC7A11的活性被抑制會導致GSH合成減少，引發(fā)氧化損傷，最終導致鐵死亡的發(fā)生。研究表明，System Xc-和GPX4的活性狀態(tài)是調節(jié)鐵死亡的關鍵機制[25]。有文獻報道，高良姜素通過激活SLC7A11/GPX4軸抑制鐵死亡，從而對腦缺血再灌注后沙鼠的海馬神經(jīng)元發(fā)揮保護作用；淫羊藿苷通過調節(jié)SLC7A11/GPX4信號通路抑制高糖誘導的小膠質細胞鐵死亡；鹿紅方通過SLC7A11/GPX4信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷引起的心肌細胞鐵死亡[26-33]。本研究結果顯示，ox-LDL組HUVECs中，GPX4和SLC7A11蛋白的表達顯著降低；而給予白藜蘆醇預處理后，細胞中GPX4和SLC7A11蛋白的表達顯著升高。由此推測，白藜蘆醇可能通過激活SLC7A11/GPX4軸來對抗ox-LDL誘導的鐵死亡。

綜上所述，調控鐵死亡可能為白藜蘆醇治療AS的重要機制，本研究結果為深入挖掘中醫(yī)藥治療AS疾病作用機制提供了新思路。但本研究僅在細胞層面初步探討了白藜蘆醇對ox-LDL誘導鐵死亡的可能作用機制，存在一定的局限性，后續(xù)將深入研究白藜蘆醇調節(jié)鐵死亡的直接機制和作用靶點。

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（本文編輯? 馬偉平）