閆偉華,趙樹超,張敏,時維平,周璇,馬曉軍

(青島大學附屬醫(yī)院,山東 青島 266000 1 病理科; 2 麻醉科)

肝癌是世界上第六大常見惡性腫瘤,也是導致癌癥相關死亡的第二大原因[1]。由于早期診斷困難,大多數(shù)肝癌病人確診時已處于中晚期而錯過了有效治療的機會,預后很差[2-3]。即使手術切除,術后生存率也不高[3]。因此,深入了解肝癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制,對于開發(fā)肝癌的早期診斷的分子生物標志物和尋找新的治療策略至關重要。

磺基轉(zhuǎn)移酶1C2(SULT1C2)是胞漿硫轉(zhuǎn)移酶1C(SULT1C)亞家族的一員,是一種Ⅱ相解毒酶,通過在靶標上添加硫酸鹽基團來促進外源物質(zhì)通過尿液或膽汁排出。SULT1C2對硝基苯酚和誘變劑N-羥基-2-乙酰氨基熒烯均表現(xiàn)出硫化活性,在致癌物質(zhì)的活化中起重要作用[4]。SULT1C2已經(jīng)被證明在人的胃、腎和甲狀腺以及胎兒肝和腎中表達[5]。目前已有研究顯示,SULT1C2在結(jié)腸腺癌細胞系LS180中表達[6],在肺腺癌中高表達并導致預后不良[7]。但關于SULT1C2在肝癌中作用的研究較少。因此,本研究通過癌癥基因組圖譜(TCGA)、基因表達綜合(GEO)和基因型-組織表達(GTEx)數(shù)據(jù)庫,并結(jié)合臨床樣本探討SULT1C2基因表達與肝癌的關系,并進一步探討其潛在的作用機制,為確定SULT1C2基因與肝癌的關系提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)資料的收集

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載33種泛癌表達數(shù)據(jù),并下載肝癌病人的臨床信息,共將341例肝癌樣本納入研究。以肝癌為關鍵詞從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選原始數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集,共9個符合條件,分別為GSE10 2097、GSE12 1248、GSE22 058、GSE25 097、GSE36 376、GSE46 444、GSE57 957、GSE76 297和GSE76 427,分別下載原始數(shù)據(jù),提取SULT1C2基因表達信息。肝癌分子圖譜數(shù)據(jù)庫(HCCDB)[8]用于進一步研究SULT1C2在泛癌、正常組織和肝癌組織中的表達。

1.2 癌和癌旁組織的收集

收集青島大學附屬醫(yī)院器官移植中心2014年3月—2017年8月切除的96對肝癌和癌旁組織,置于-80 ℃保存用于SULT1C2在肝癌中表達的研究。術前已告知病人及其家屬標本的采集不會造成任何額外的經(jīng)濟和健康負擔。所有參與者都簽署了書面知情同意書。

1.3 總RNA的提取

稱量冷凍的肝癌和癌旁組織100 mg,加入含800 μL Trizol裂解液的1.5 mL離心管并用組織破碎儀破碎。組織勻漿置于4 ℃離心機1 500 r/min離心5 min,上清轉(zhuǎn)移至新的離心管于室溫裂解5 min。組織裂解液加入160 μL的氯仿,混勻,平衡15 min。混合液于4 ℃條件下、12 000 r/min離心10 min,上層RNA轉(zhuǎn)移入新的EP管。RNA用異丙醇沉淀并通過離心分離,分離并沉淀后的RNA用體積分數(shù)為0.75的乙醇洗滌。RNA干燥后用DEPC水10 μL溶解。

1.4 cDNA的合成

SuperScript?Ⅲ First-Strand Synthesis kit用于cDNA的合成。將cDNA合成試劑盒平衡至室溫,使用前將每種成分混合并短暫離心。將總RNA(≤2.5 μg)、dNTP混合物(1 mmol/L)、隨機引物(5 mg/L)和水添加至體積5 μL。將RT緩沖液、RNaseOUT(2 U)、DDT(10 mmol/L)、SuperScript?Ⅲ(10 U)和MgCl2(5 mmol/L)添加到PCR管至總體積為10 μL。隨后,在PCR儀中運行標準的cDNA合成程序。合成的cDNA用DEPC水稀釋至200 μL,并在-20 ℃下儲存。

1.5 qRT-PCR檢測組織中SULT1C2的表達

在平衡至室溫后,將引物、Sybr Green和cDNA充分混合。在短暫離心后,在384孔PCR板中加入3.8 μL雙蒸水、1.0 μL cDNA、5.0 μL Sybe Green和0.2 μL引物(10 μmol/L)制備PCR溶液。PCR程序:95 ℃變性15 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,共進行40個循環(huán)。Sybr Green用于確定Cq值。管家基因GAPDH用于校驗靶基因的表達水平。PCR所用引物及其序列見表1。

表1 PCR擴增引物及其序列

1.6 統(tǒng)計學分析

TCGA下載泛癌數(shù)據(jù)后,以SULT1C2表達值為標準,將病人分為SULT1C2高表達和低表達兩組。Limma R包用于差異分析,clusterProfiler R用于基因富集分析(GSEA),pheatmap用于熱圖的繪制,用Kapalan-Meier曲線分析SULT1C2對肝癌病人生存的影響,用Pearson法檢驗SULT1C2與信號通路間的線性關系,t檢驗用于檢測兩組數(shù)據(jù)間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 SULT1C2基因在肝癌組織中的表達

應用HCCDB在線HCC數(shù)據(jù)庫研究SULT1C2在正常組織、泛癌組織和肝癌組織中的表達。研究結(jié)果顯示,SULT1C2在各種器官和組織中表達的均值為0.89,而SULT1C2在泛癌的腫瘤組織中的表達高于癌旁組織(6.67vs3.67)。見圖1A。其中,SULT1C2基因在結(jié)腸癌(COAD)、嫌色腎細胞癌(KICH)、 肝癌(LICH)和肺腺癌(LUAD) 組織高表達,在食管癌(ESCA)、腎透明細胞癌(KIRC)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、 肺鱗狀細胞癌(LUSC)和甲狀腺癌(THCA)組織中低表達。見圖1B。肝癌組織中SULT1C2的表達高于癌旁、肝硬化組織和正常組織。見圖2A。同樣,GEO數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,SULT1C2在多個肝癌數(shù)據(jù)集的腫瘤組織中高表達。見圖2B。采用qRT-PCR檢測進一步驗證這一結(jié)果,證實了SULT1C2在肝癌組織中的高表達。見圖2C。

A:HCCDB在線數(shù)據(jù)庫中SULT1C2在正常組織中的表達,綠色虛線表示均值;B:HCCDB在線數(shù)據(jù)庫中SULT1C2在泛癌和癌旁組織中的表達,紅色表示癌癥樣本,藍色表示正常組織,紅線表示癌癥樣本的表達均值,藍線表示正常組織的表達均值。與癌旁組織相比,*P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1。

A:SULT1C2在HCCDB數(shù)據(jù)庫HCC數(shù)據(jù)集中腫瘤組織、肝硬化組織、癌旁和正常組織中的表達;B:SULT1C2在GEO數(shù)據(jù)庫HCC數(shù)據(jù)集中癌和癌旁組織中的表達;C:qRT-PCR檢測93對肝癌和癌旁組織中SULT1C2的表達。紅色表示SULT1C2高表達樣本,藍色表示SULT1C2低表達樣本。與癌旁組織相比,***P<0.001,****P<0.000 1。

2.2 肝癌組織中SULT1C2基因表達與病人預后的關系

對TCGA數(shù)據(jù)庫中的肝癌組織進行Kaplan-Meier分析,結(jié)果顯示,SULT1C2高表達組病人的總體生存率(OS)低于低表達組(高風險=125,低風險=245,P<0.01)。見圖3A。高表達組病人疾病特異性生存率(DSS)也低于低表達組(高風險=114,低風險=248,P<0.05)。見圖3B。然而,高表達組病人的無病生存率(DFI)和無進展生存率(PFI)與低表達組比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖3C、D。

A:SULT1C2基因不同表達病人的OS;B:SULT1C2基因不同表達病人的DSS;C:SULT1C2基因不同表達病人的DFI;D:SULT1C2基因不同表達病人的PFI。

2.3 SULT1C2相關信號通路GSEA分析

GSEA分析結(jié)果顯示,SULT1C2表達在不同腫瘤組織中信號通路并不完全一致,信號通路在不同組織可能被激活或抑制。見圖4A和圖4B。與泛癌不同的是,E2F、G2M檢查點和MYC信號通路的基因頻率和基因數(shù)量在SULT1C2表達肝癌中是被激活最高和最多的。見圖4C、D。

A:GESA分析SULT1C2表達在泛癌中調(diào)節(jié)的信號通路;B:SULT1C2表達在泛癌中激活/抑制信號的比率;C:E2F、G2M檢查點和MYC信號通路在SULT1C2表達的肝癌中被激活;D:E2F、G2M檢查點和MYC信號通路與肝癌中SULT1C2表達正相關。

3 討 論

SULT超家族的酶參與外源物質(zhì)和內(nèi)源化合物的代謝,并調(diào)節(jié)激素的生物活性[9]。基于它們不同的作用,評估SULTs的表達和調(diào)控對于理解個體對藥物和毒物的反應以及疾病病因?qū)W具有重要意義[10-11]。SULT1C是SULT家族的一個分支,位于染色體2q12上,是胎兒發(fā)育過程中代謝和致癌的一個潛在的重要決定性因素。然而,人們對其生理功能仍知之甚少,主要是由于SULT1C在胎兒期表達,而在成人組織中低表達[4,12-13]。SULT1C2是第一個被克隆的人類SULT1C成員[5],其在肝癌中的研究較少。本文研究結(jié)果顯示,SULT1C2在肝癌組織中高表達,且其高表達時病人預后較差。

細胞內(nèi)存在一系列嚴密的調(diào)控機制,以確保細胞周期不同時期的有序進行。細胞周期的嚴密調(diào)控可因基因突變、缺失、異位、擴增等改變而發(fā)生紊亂以致形成腫瘤[14]。作為視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白下游的效應因子,E2Fs通過細胞周期蛋白的進入調(diào)控細胞周期的進程[15]。MYC是細胞增殖過程中必不可少的轉(zhuǎn)錄因子,通過反式作用調(diào)控細胞的發(fā)育、生長和分化。MYC的異常表達誘導細胞對生長因子的依賴性減少,從而導致細胞永生化和細胞特性的改變[14-15]。SULT1C2表達的信號通路在不同的腫瘤組織中并不完全一致,可能是由于其信號通路在不同的組織中被激活或抑制。

綜上所述,本文生信分析結(jié)果提示,SULT1C2基因在肝癌中高表達,它可能通過激活E2F、G2M檢查點和MYC信號通路誘導肝癌病人的不良預后,故SULT1C2有望成為肝癌潛在的診治新靶點。本研究存在不足之處,即未闡明SULT1C2基因是如何通過E2F、G2M檢查點和MYC信號通路影響肝細胞癌的進展。因此,今后的研究將進一步探討SULT1C2在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機制,以期為其成為肝癌潛在的早期診斷和治療新靶點提供線索。