沙庫巴曲纈沙坦對血管平滑肌細胞增殖的影響

徐從鳳,王妮,趙明明,張寧,王立韌,李永紅

(青島大學附屬醫院心血管內科,山東 青島 266100)

缺血性心臟病是目前威脅人類健康的主要原因[1],經皮冠狀動脈介入術(PCI)是冠心病病人重要治療方法,血管支架尤其是藥物洗脫支架應用極大程度改善了冠心病病人的療效和預后[2-3]。然而,該療法存在支架內再狹窄(ISR)的并發癥,嚴重影響了PCI的療效,也是目前醫學領域面臨的尚未解決的難題之一[3]。ISR的病理生理學機制復雜[4],所涉及的主要機制包括血管內皮損傷、血管平滑肌細胞(VSMCs)的增殖和遷移、炎癥反應、血管外基質重構等,VSMCs的異常增殖和遷移是冠狀動脈粥樣硬化和冠狀動脈ISR的主要病理基礎[5]。沙庫巴曲纈沙坦(Entresto)是一種治療心力衰竭藥物[6],主要由血管緊張素受體抑制劑纈沙坦(Valsartan)和腦啡肽酶抑制劑沙庫巴曲組成[7]。腦啡肽酶抑制劑沙庫巴曲可以抑制腦啡肽酶(NEP)活性,并減少 NEP對利鈉肽(NP)以及其他血管活性肽的降解[8]。NP主要包括A型利鈉肽(ANP)、B型利鈉肽(BNP)、C型利鈉肽(CNP),NP與受體結合后能增加細胞內第二信使cGMP的含量,并作用于下游信號通路發揮抑制VSMCs增殖的作用[9-10]。相關研究證明,Valsartan可以通過多條信號通路抑制VSMCs的增殖[11]。目前,Entresto對VSMCs增殖與遷移影響的研究較少。本研究觀察Entresto對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激下人主動脈平滑肌細胞(HA-VSMCs)增殖與遷移的影響,探討Entresto在預防ISR中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HA-VSMCs加入DMEM培養液(含10 g/L青霉素-鏈霉素和體積分數0.10胎牛血清),培養箱中培養。AngⅡ、Entresto購自AbMole,增殖細胞核抗原(PCNA)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)抗體購自上海愛必信生物科技有限公司,CCK8試劑盒、蛋白濃度測定(BCA)試劑盒、ECL化學發光劑、胰蛋白酶、胎牛血清、高糖DMEM培養液等購自大連美侖生物技術有限公司,RNA提取試劑Trizol購自北京博邁斯科技發展有限公司,實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒來自艾科瑞生物,引物由青島德羅海達生物技術有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組 將HA-VSMCs接種于6孔培養板中,無血清培養液饑餓培養24 h后,按以下方法進行分組處理:AngⅡ組(B組),加入AngⅡ(1×10-6mol/L);AngⅡ+Entresto組(C組),加入Entresto(1×10-5mol/L)作用1 h之后再加入AngⅡ(1×10-6mol/L);對照組(A組),不加AngⅡ和Entresto。各組均培養24 h。

1.2.2CCK8檢測細胞增殖 將HA-VSMCs接種在96孔板中,待細胞融合至80%時,換無血清培養液饑餓處理24 h。按1.2.1方法分組并加入相應藥物培養24 h,向每孔中加入10 μL CCK8試劑繼續培養2 h,在酶標儀上檢測450 nm波長處各孔的光密度(OD)值,以其表示細胞增殖活性。每組設 5個復孔,實驗重復3次。

1.2.3細胞劃痕實驗檢測細胞遷移活性 將HA-VSMCs接種到6孔板中,待細胞貼壁生長至密度70%～80%時,更換為無血清培養液饑餓處理24 h。使用 1 000 μL的無菌槍頭垂直在細胞板上均勻劃線,造成幾條劃痕。PBS 洗滌3次去除劃掉的細胞,加含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養液,按1.2.1方法分組并加入相應藥物,每隔12 h顯微鏡下觀察細胞劃痕開口率,并采集圖像。

1.2.4qRT-PCR檢測PCNA及MMP-9mRNA表達 HA-VSMCs按照1.2.1方法分組并加入相應藥物,培養24 h后棄去培養液,每孔細胞加入500 μL Trizol裂解核蛋白提取總mRNA,應用逆轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA;根據SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit說明書將所獲得的cDNA進行qRT-PCR,檢測PCNA以及MMP-9mRNA表達。PCR引物及其序列見表1。

表1 PCR引物及其序列

1.2.5Western blot檢測PCNA及MMP-9蛋白表達 按1.2.1方法分組并加入相應藥物,作用24 h后棄去培養液,PBS洗3次后,加含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液充分裂解,應用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品加樣,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,三明治法轉膜,250 mA恒流1 h,應用快速封閉液封閉15 min后洗膜。將膜分別加入PCNA抗體(1∶1 000)、MMP-9抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000)中,4 ℃搖床孵育過夜,洗滌后放入二抗(1∶5 000)中室溫孵育2 h。采用ECL化學發光方法顯影后,在蛋白凝膠成像系統上采集條帶,以β-actin進行標定,采用Image J軟件對各條帶灰度值進行分析,計算各組VSMCs中PCNA及MMP-9蛋白相對表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組VSMCs增殖活性比較

對照組、AngⅡ組及AngⅡ+Entresto組的OD值分別為1.00±0.06、2.08±0.12、1.01±0.12,各組之間相比較差異有統計學意義(F=164.10,P<0.05)。兩兩比較顯示, AngⅡ組VSMCs增殖活性較對照組升高(t=17.67,P<0.05),AngⅡ+En-tresto組VSMCs增殖活性較AngⅡ組降低(t=13.55,P<0.05)。

2.2 各組VSMCs遷移活性比較

劃痕實驗顯示,各組0 h時的劃痕開口率差異無顯著性(P>0.05),在12～36 h劃痕開口率組間差異有統計學意義(F=16.54～58.64,P<0.05)。與對照組相比較,AngⅡ組VSMCs的劃痕開口率在12～36 h明顯降低(t=4.04～8.78,P<0.05),提示VSMCs的遷移程度增加;與AngⅡ組相比較,AngⅡ+Entresto組VSMCs的劃痕開口率在12～36 h更高(t=5.79～9.32,P<0.05)。見圖1。

A:各組劃痕實驗結果;B:各組0～36 h劃痕開口率比較。

2.3 各組VSMCs中 PCNA、MMP-9 mRNA和蛋白表達比較

各組VSMCs 中PCNA及MMP-9的mRNA和蛋白表達差異均有顯著性(F=33.32～177.20,P<0.05)。與對照組相比較,AngⅡ組VSMCs中PCNA、MMP-9的mRNA和蛋白表達量增加(t=7.07～22.93,P<0.05);與AngⅡ組相比,AngⅡ+Entresto組VSMCs中PCNA、MMP-9的mRNA及蛋白表達均降低(t=5.78～15.82,P<0.05)。見圖2和表2。

A:對照組;B:AngⅡ組;C:AngⅡ+Entresto組。

表2 各組VSMCs中PCNA、MMP-9 mRNA及蛋白表達比較

3 討 論

VSMCs的異常增殖與遷移是ISR最主要的病理生理機制[12]。正常生理情況下,VSMCs存在于血管中膜,組成血管壁結構及調節血管張力以維持血壓[13-14]。支架植入術后血管內皮損傷,內膜下成分如膠原纖維、纖維連接蛋白等暴露,使血小板活化,聚集黏附在損傷處形成局部血栓[15]。單核細胞釋放炎性介質及趨化因子[16],促進VSMCs由收縮表型轉變為合成表型遷入內膜中,細胞的增殖及遷移能力增加[17],VSMCs分泌大量的血小板源性生長因子(PDGF)、α成纖維細胞生長因子、TGF-β等細胞因子及細胞外基質[18],致病理性內膜新生的進程加快,導致ISR的發生。

Entresto主要由沙庫巴曲和Valsartan以鈉鹽復合物1∶1的摩爾比例結合而成[19],這種結合可解決兩種病理生理機制:腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)的激活和對NP敏感性的下降[20]。有研究表明,Entresto對來自特發性肺動脈高壓病人的人肺動脈平滑肌細胞具有抗增殖作用[21],但是其對HA-VSMCs增殖的影響尚未見有報道。

PCNA是評估細胞增殖狀態的常用指標,在細胞各周期中均有表達[22]。MMP-9又被命名為明膠酶B,屬于基質金屬蛋白酶家族,能夠降解血管基膜和細胞外基質[23],是細胞遷移過程中重要的標志指標。已有研究顯示,MMP-9的過度表達可以促進VSMCs遷移至血管內膜,減少內膜基質含量[24]。本研究CCK8及細胞遷移實驗結果顯示,Entresto可以抑制AngⅡ誘導的VSMCs增殖活性及遷移程度,且使PCNA及MMP-9的表達量較AngⅡ組降低。說明Entresto能夠抑制AngⅡ誘導的VSMCs增殖及遷移。其可能的作用機制如下。①AngⅡ與AT1受體(AT1R)結合,Valsartan作為AT1R的拮抗劑抑制其促VSMCs增殖與遷移作用[11]。有研究結果表明,Valsartan能夠降低AngⅡ誘導的P38絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)蛋白表達水平,進而抑制VSMCs的遷移和增殖[25]。除此之外,Notch、PI3K/AKT相關信號通路、TGF-β及下游信號分子、Wnt信號通路等均參與了VSMC的增殖和遷移的過程[26-29],Valsartan可能通過阻斷這些通路從而發揮抑制VSMCs增殖的作用。同時,沙庫巴曲在抑制腦啡肽酶分解的同時,也抑制了Ang Ⅰ、Ang Ⅱ等多種肽類的降解[30-31],從而使AngⅡ的濃度升高促進VSMCs的增殖。Valsartan很好地彌補了沙庫巴曲的缺點[32]。AngⅡ濃度增高可以對抗傳統ACE-AngⅡ-AT1軸促VSMCs增殖遷移的作用[33]。②NP除了具有利尿、利鈉、擴張血管、抗心肌肥厚和纖維化、抑制RAAS、內皮素和交感神經活性等作用外,NP家族成員ANP、BNP及CNP與受體結合后,均能影響VSMCs的增殖[10]。ANP和CNP可以通過鳥苷酸偶聯受體介導降低MAPK活性,兩者均可以呈劑量依賴性抑制PDGF誘導的VSMCs增殖[34-35]。相關研究還表明,大鼠過表達CNP可引起cGMP級聯激活以誘導G1期VSMCs生長抑制,調節VSMCs表型[36]。BNP可通過鳥苷酸偶聯受體A降低細胞內活性氧和NAD(P)H氧化酶的活性,進而抑制AngⅡ誘導的VSMCs增殖[37]。此外,NP還有抑制成纖維細胞增殖及心肌細胞增生肥大的作用[38],故Entresto與支架術后再狹窄的發展過程密切相關,可能會降低支架植入后的再狹窄率。

綜上所述,Entresto可抑制VSMCs的移行、增殖,對PCI后再狹窄的防治具有潛在價值。但其具體信號轉導機制、體內研究結果及在臨床實踐中的應用尚有待于進一步探討。