白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡影響

游福蓉,杜占慧,宗麗娟,王勤拯,張成,邢泉生

(青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院,山東 青島 266034 1 心臟中心; 2 普外科)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是以脂質(zhì)蓄積和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征的慢性炎癥性過(guò)程,是冠心病、心肌梗死、腦卒中等眾多心腦血管事件的病理基礎(chǔ)[1-3]。AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,與多種因素密切相關(guān),其中內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)[4]。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有利于氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)浸潤(rùn)至內(nèi)皮下層,同時(shí)選擇性招募單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下層轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞,通過(guò)吞噬經(jīng)理化修飾的脂蛋白形成泡沫細(xì)胞引發(fā)局部炎癥反應(yīng),從而誘導(dǎo)AS的發(fā)生發(fā)展[3,5]。鐵死亡是近年發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴的新型細(xì)胞死亡方式,其特征是鐵依賴的活性氧(ROS)和脂質(zhì)過(guò)氧化物的蓄積、谷胱甘肽(GSH)的耗竭以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)的失活等[1-2]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明,鐵死亡是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的重要原因,在推動(dòng)AS進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[3-4]。白藜蘆醇為一種天然植物多酚,主要存在于葡萄、花生、虎杖、大豆等多種植物中,具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、延緩衰老等功效[6-7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可通過(guò)調(diào)節(jié)血脂水平、抗血小板聚集、抗炎、抑制低密度脂蛋白氧化修飾、抑制斑塊內(nèi)新生血管等作用發(fā)揮抗AS作用[8-10]。但有關(guān)白藜蘆醇對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究利用鐵死亡誘導(dǎo)劑ox-LDL建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)鐵死亡模型,探討白藜蘆醇對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡的影響及機(jī)制,從而為明確中醫(yī)藥治療AS疾病作用機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

HUVECs購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司;ox-LDL購(gòu)自美國(guó)默克公司;白藜蘆醇,分子式為C14H12O3,分子量228.24,純度99.94%,購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司;ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)白鯊生物有限公司;亞鐵離子(Fe2+)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾公司;GSH及丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;CCK-8溶液購(gòu)自武漢Proteintech公司;兔抗GPX4以及鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;兔抗鐵蛋白重鏈(FTH1)單克隆抗體購(gòu)自Abmart公司;兔抗溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)單克隆抗體、山羊抗兔lgG-HRP及山羊抗鼠lgG-HRP二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HUVECs置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中,用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。將正常的HUVECs隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、ox-LDL組(B組)及白藜蘆醇低、中、高劑量組(C、D、E組)。A組在正常生長(zhǎng)條件下培養(yǎng),B組加入含有100 mg/L ox-LDL的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,C、D、E組分別用白藜蘆醇5、10、20 μmol/L預(yù)處理4 h后,更換為含有100 mg/L ox-LDL的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs,以每孔5 000個(gè)接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁、按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物處理后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h,應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的光密度(OD)值。然后計(jì)算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3細(xì)胞中Fe2+、ROS、MDA和GSH含量檢測(cè)將HUVECs按每孔2×105個(gè)接種于6孔板內(nèi),在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物進(jìn)行處理。收集各組細(xì)胞,使用Fe2+、ROS、GSH、MDA檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Fe2+、ROS、GSH、MDA含量,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GPX4、SLC7A11和FTH1蛋白表達(dá) 將HUVECs接種于6孔板,按照實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物處理。收集各組細(xì)胞并提取總蛋白,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳反應(yīng)后,轉(zhuǎn)膜、封閉,加入一抗(β-actin、GPX4、FTH1和SLC7A11,以1∶1 000抗體稀釋液稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜,加入羊抗兔二抗(以1∶5 000抗體稀釋液稀釋)和羊抗鼠二抗(以1∶10 000抗體稀釋液稀釋)室溫孵育1 h,洗去二抗,用ECL試劑盒顯色,在凝膠成像儀上顯影并拍照,用Image J軟件分析條帶灰度值。結(jié)果以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GPX4、SLC7A11和FTH1表達(dá) 將HUVECs按每孔2×103個(gè)接種于24孔板內(nèi),在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,按實(shí)驗(yàn)分組加入相應(yīng)藥物處理。用40 g/L多聚甲醛室溫固定15 min,PBS浸洗,5 g/L Triton X-100透膜15 min,50 g/L BSA封閉1 h,去除封閉液,加入GPX4(應(yīng)用1∶200抗體稀釋液稀釋)、SLC7A11(應(yīng)用1∶200抗體稀釋液稀釋)以及FTH1(以1∶100抗體稀釋液稀釋)一抗4 ℃孵育過(guò)夜。用PBS洗凈一抗后,加入熒光標(biāo)記的羊抗兔二抗(以1∶200抗體稀釋液稀釋)室溫避光孵育1 h。用PBS洗凈二抗后,以DAPI染核10 min,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。應(yīng)用Image J軟件分析記錄每張圖片的平均熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 ox-LDL和白藜蘆醇對(duì)HUVECs存活率影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ox-LDL濃度為50、100、150、200 mg/L逐漸升高時(shí),HUVECs存活率逐漸降低。當(dāng)ox-LDL濃度為100 mg/L時(shí),與對(duì)照相比,細(xì)胞存活率為54.30%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=655.08,P<0.01)。因此,為保證有足夠活力的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),本研究選擇100 mg/L ox-LDL干預(yù)24 h作為誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的條件。見(jiàn)圖1。與對(duì)照相比,5、10、20 μmol/L濃度的白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響(P>0.05),說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中所用不同劑量的白藜蘆醇對(duì)HUVECs無(wú)損傷作用。見(jiàn)圖2。

注:n=4,*P<0.01。

注:n=4,ns表示P>0.05。

2.2 白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs存活率的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組HUVECs存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=200.00,P<0.01)。B組細(xì)胞存活率較A組顯著降低(P<0.01);而經(jīng)低、中、高劑量白藜蘆醇預(yù)處理可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷,并呈劑量依賴性,與B組比較,C、D、E組細(xì)胞存活率顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

注:n=4;與A組相比,*P<0.01;與B組相比,#P<0.01。

2.3 白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs中ROS、MDA、GSH和Fe2+含量的影響

各組HUVECs中ROS、MDA、GSH和Fe2+含量比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.26～415.07,P<0.05)。與A組相比,B組HUVECs中ROS、MDA和Fe2+含量顯著增加,而GSH含量顯著降低(P<0.05);與B組相比較,C、D、E組HUVECs中ROS、MDA和Fe2+含量顯著降低,GSH含量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組HUVECs中GSH、MDA、Fe2+和ROS含量的比較

2.4 白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達(dá)的影響

免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示,各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達(dá)比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.62～88.92,P<0.05)。與A組相比較,B組HUVECs中GPX4、FTH1以及SLC7A11蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05);與B組相比較,C、D、E組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖4和表2。

表2 各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達(dá)的比較

圖4 免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達(dá)

免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示,各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達(dá)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.18～722.16,P<0.05)。與A組相比,B組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與B組相比,E組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖5和表3。

表3 各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達(dá)的比較

A、B、C分別示A組、B組和E組GPX4的表達(dá),綠色為GPX4染色,藍(lán)色為DAPI熒光染色下的細(xì)胞核;D、E、F分別示A組、B組和E組FTH1的表達(dá),綠色為FTH1染色,藍(lán)色為DAPI熒光染色下的細(xì)胞核;G、H、I分別示A組、B組和E組SLC7A11的表達(dá),綠色為SLC7A11染色,藍(lán)色為DAPI熒光染色下的細(xì)胞核。白色箭頭示目的蛋白表達(dá)區(qū)域。免疫熒光染色,100倍。

3 討 論

隨著社會(huì)老齡化加重及居民不健康生活方式增加,我國(guó)AS誘發(fā)的多種心血管疾病發(fā)病率、死亡率持續(xù)升高。AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血栓形成及脂質(zhì)浸潤(rùn)等密切相關(guān)[1-3]。目前逆轉(zhuǎn)AS嚴(yán)重后果的療法仍然有限。白藜蘆醇作為多酚類植物化合物的代表,可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制ROS生成、維持內(nèi)皮功能穩(wěn)定等來(lái)發(fā)揮抗AS作用。但白藜蘆醇的具體作用機(jī)制至今尚未完全闡明。因此,本研究從鐵死亡的角度來(lái)探討白藜蘆醇對(duì)AS的作用及其潛在機(jī)制。有研究表明,血管內(nèi)皮細(xì)胞用ox-LDL處理后表現(xiàn)出鐵死亡的特征,使用鐵死亡抑制劑則明顯逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞的死亡[11]。因此,本研究使用ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生鐵死亡。本文結(jié)果顯示,ox-LDL處理后內(nèi)皮細(xì)胞活力明顯下降,出現(xiàn)鐵死亡;經(jīng)白藜蘆醇(5、10、20 μmol/L)預(yù)處理可以降低細(xì)胞鐵死亡,減少ROS和MDA產(chǎn)生,顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞活力,且該效應(yīng)隨著白藜蘆醇劑量增加而增強(qiáng)。這表明白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的鐵死亡有拮抗作用,從而可以延緩AS病程進(jìn)展。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS早期病理改變。有研究表明,鐵死亡通過(guò)多種生理機(jī)制參與AS的內(nèi)皮細(xì)胞損傷,如鐵過(guò)載可以促進(jìn)ROS產(chǎn)生并且激活局部腎素-血管緊張素系統(tǒng),誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平升高,導(dǎo)致內(nèi)皮損傷,增加AS斑塊的不穩(wěn)定性[12];鐵死亡抑制劑通過(guò)減輕鐵死亡引起的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷而發(fā)揮抗AS作用[3]。由此可見(jiàn),鐵死亡已成為調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)鍵角色。

鐵死亡是一種鐵依賴的可調(diào)節(jié)的氧化性細(xì)胞死亡方式[13],在生物化學(xué)方面表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)GSH/GPX4失活,過(guò)量的Fe2+通過(guò)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量的ROS,與細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物積累,使MDA生成增多。本研究經(jīng)ox-LDL處理的HUVECs中,Fe2+、ROS和MDA含量增加,FTH1和GSH水平下降;而白藜蘆醇干預(yù)可降低細(xì)胞內(nèi)Fe2+、ROS和MDA含量,提高FTH1和GSH的水平。MDA是ROS介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化生成的一種不飽和醛類物質(zhì),由于它與親核化合物的反應(yīng)性以及在沒(méi)有活性的情況下,能使蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生反應(yīng),生成特殊的加合物而產(chǎn)生細(xì)胞毒性[14]。相關(guān)研究表明,MDA可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子,從而加重血管周圍的炎癥反應(yīng)并損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,破壞內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整性并造成內(nèi)皮功能障礙,促進(jìn)AS的發(fā)生[15]。因此,MDA被認(rèn)為是造成血管功能障礙的介質(zhì)之一。GSH是體內(nèi)的非酶抗氧化劑,可以作為硒依賴性GPX4的輔因子和底物來(lái)減少脂質(zhì)過(guò)氧化物,在降低氧化應(yīng)激水平中起著關(guān)鍵作用[16-19]。由此可見(jiàn),白藜蘆醇通過(guò)提高HUVECs抗氧化能力和降低MDA含量來(lái)減輕ox-LDL誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞損傷。鐵蛋白為細(xì)胞提供了一種以氧化還原非活性形式鎖住過(guò)量鐵的手段,以防止鐵介導(dǎo)的細(xì)胞和組織損傷。鐵蛋白由鐵蛋白輕鏈和FTH1構(gòu)成,是一種儲(chǔ)鐵蛋白復(fù)合體,可調(diào)控儲(chǔ)存的鐵離子。FTH1在鐵蛋白結(jié)構(gòu)中起到關(guān)鍵作用,也是鐵死亡發(fā)生的標(biāo)志性蛋白,可催化Fe2+氧化發(fā)揮儲(chǔ)鐵功能進(jìn)而減少細(xì)胞內(nèi)Fe2+。FTH1水平降低導(dǎo)致體內(nèi)Fe2+水平升高,過(guò)量的Fe2+會(huì)引起脂質(zhì)代謝紊亂,導(dǎo)致ROS水平升高,促進(jìn)鐵死亡發(fā)生[18,20]。本研究結(jié)果表明,白藜蘆醇能夠通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激清除過(guò)量的Fe2+,抑制鐵死亡的發(fā)生。

GPX4作為細(xì)胞內(nèi)唯一可直接降低磷脂過(guò)氧化的抗氧化酶,是鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子[21]。GPX4以GSH為還原劑,催化過(guò)氧化物的過(guò)氧鍵轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基,將過(guò)氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)轭愔?使其失去氧化活性,進(jìn)而抑制鐵死亡[16,22]。GSH和GXP4被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的標(biāo)志物[23-24]。本研究結(jié)果顯示,ox-LDL組HUVECs存活率降低,GSH含量降低,GPX4蛋白的表達(dá)下調(diào);給予白藜蘆醇預(yù)處理后,細(xì)胞存活率升高,GSH含量升高,GPX4蛋白表達(dá)上調(diào),提示白藜蘆醇可以減輕HUVECs鐵死亡。

SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸交換轉(zhuǎn)運(yùn)體(System Xc-)的底物特異性亞基,在抗氧化劑GSH的生物合成中起著核心作用。SLC7A11的活性被抑制會(huì)導(dǎo)致GSH合成減少,引發(fā)氧化損傷,最終導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生。研究表明,System Xc-和GPX4的活性狀態(tài)是調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵機(jī)制[25]。有文獻(xiàn)報(bào)道,高良姜素通過(guò)激活SLC7A11/GPX4軸抑制鐵死亡,從而對(duì)腦缺血再灌注后沙鼠的海馬神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用;淫羊藿苷通過(guò)調(diào)節(jié)SLC7A11/GPX4信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞鐵死亡;鹿紅方通過(guò)SLC7A11/GPX4信號(hào)通路減輕心肌缺血再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞鐵死亡[26-33]。本研究結(jié)果顯示,ox-LDL組HUVECs中,GPX4和SLC7A11蛋白的表達(dá)顯著降低;而給予白藜蘆醇預(yù)處理后,細(xì)胞中GPX4和SLC7A11蛋白的表達(dá)顯著升高。由此推測(cè),白藜蘆醇可能通過(guò)激活SLC7A11/GPX4軸來(lái)對(duì)抗ox-LDL誘導(dǎo)的鐵死亡。

綜上所述,調(diào)控鐵死亡可能為白藜蘆醇治療AS的重要機(jī)制,本研究結(jié)果為深入挖掘中醫(yī)藥治療AS疾病作用機(jī)制提供了新思路。但本研究?jī)H在細(xì)胞層面初步探討了白藜蘆醇對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)鐵死亡的可能作用機(jī)制,存在一定的局限性,后續(xù)將深入研究白藜蘆醇調(diào)節(jié)鐵死亡的直接機(jī)制和作用靶點(diǎn)。