L-賴氨酸與谷氨酰胺轉氨酶聯合處理對低鹽雞肉糜凝膠保水及質構品質的影響

王 昱，王家樂，袁晶晶，李 可，栗俊廣，趙慧娟，白艷紅,*

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001；3.食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001；4.河南鏈多多供應鏈管理有限公司，河南 鶴壁 456750）

凝膠類肉制品（包括糜類制品、乳化型制品、碎肉制品等），因其具有食用方便，口感鮮美，營養豐富等優點，深受消費者的喜愛，成為我國肉制品發展的主要趨勢[1-2]。在凝膠類肉制品的生產加工中，需要較高含量（2%～3%）的食鹽（NaCl）萃取肌原纖維蛋白，使其在加熱過程中能互相交聯、聚集，形成黏彈性好、結構穩固的三維凝膠網絡，從而提高產品的保水性（water holding capacity，WHC）和質構特性[3-4]。據報道，目前我國人均食鹽攝入量約為10 g/d，遠高于世界衛生組織和《中國居民膳食指南（2022）》的推薦攝入量（5 g/d）[5-6]。鈉鹽的過量攝入，會導致血壓升高，進而增加心血管疾病的發生風險。肉制品約貢獻每日食鹽總攝入量的16%～25%[7]，因此，低鹽肉制品的開發是促進健康飲食的重要途徑。由于NaCl發揮眾多的功能作用，直接降低凝膠類肉制品中的NaCl含量，會使產品出現質量劣變，如WHC降低、質構松散、風味喪失等[8]。如何有效避免減鹽帶來肉制品品質下降，是肉品研究領域需要解決的一個難題。

谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TGase）是一種小分子單體蛋白質，能催化肉蛋白發生?-(γ-谷氨酰基)-賴氨酸共價交聯反應，起到促進肉蛋白凝膠形成的作用，進而對肉制品的乳化穩定性、質地、流變學特性等產生積極影響，在肉制品中應用廣泛[9-12]。但是，TGase對肉制品WHC結果并不一致。如Cando等[11]報道，TGase能提高肉糜制品的WHC，而Lesiow等[12]發現，TGase增加了豬肉糜凝膠的水分流失。另外，在低鹽條件下，肌原纖維蛋白的結構較緊湊，難以暴露足夠數量的谷氨酰胺和賴氨酸殘基作為TGase反應底物，從而不利于TGase催化交聯反應的進行[13]。因此，為更好利用TGase改善低鹽肉制品品質，有必要將TGase與其他技術手段進行聯合。

L-賴氨酸作為一種堿性氨基酸（等電點＞7.0），可作為食品增香劑、發色劑及營養強化劑用于食品加工，不會引入有害物質，因此是一種綠色的改性策略。GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中規定，L-賴氨酸可作為食品用天然香精香料，且未作限量要求。近年來，L-賴氨酸在肉制品加工中的應用日益受到研究人員的關注。研究顯示，L-賴氨酸能提高肉體系pH值，改變肉蛋白構象，提高肉蛋白分子柔性，從而改善肉蛋白的溶解性、乳化性、凝膠性等加工特性，提升肉制品的功能特性[14-16]。由于L-賴氨酸引起的蛋白質分子的解折疊會促進蛋白質活性基團的暴露[17]，因此，L-賴氨酸具有增強TGase與肉蛋白之間交聯反應的潛力。然而，L-賴氨酸與TGase聯合處理對低鹽凝膠類肉制品品質的影響，還鮮見報道。

本研究以低鹽（含質量分數1% NaCl）雞肉糜（lowsalt chicken meat batter，LCMB）為對象，考察不同質量分數（0.25%、0.5%、0.75%、1%）L-賴氨酸結合TGase（0.5%質量分數）處理對LCMB凝膠WHC、質構、微觀結構、蛋白質構象的影響，闡明L-賴氨酸和TGase協同處理對LCMB凝膠品質的影響規律及機制，旨在為高品質低鹽凝膠肉制品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞胸肉購于鄭州大張超市，去除雞胸肉表面的脂肪及筋膜，然后切成小塊，用絞肉機絞碎，進行真空包裝并貯存于－20 ℃。

NaCl（食品級）河南明瑞食品添加劑有限公司；L-賴氨酸（99.5%，食品級）上海金源生物技術有限公司；TGase（100 U/g，食品級）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HM740絞肉機 青島漢尚電器有限公司；GM200斬拌機 德國Restch公司；CR-GIII高速冷凍離心機、Regulus 8100冷場發射掃描電鏡 日本日立公司；TA-XT Plus質構儀 英國Stable Micro System公司；Lab-1-50冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；Renishaw/in Via激光顯微共聚焦拉曼光譜儀 英國雷尼紹公司；NMI20低場核磁共振成像分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LCMB的制備

冷凍貯藏的雞胸肉置于4 ℃環境中解凍過夜[18]；然后放入斬拌機，2 000 r/min斬拌60 s；隨后加入食鹽和1/2冰水，2 000 r/min斬拌60 s；根據不同配方組成（表1），各組依次加入相同質量分數TGase（占肉糜總質量0.5%）及不同質量分數L-賴氨酸（占肉糜總質量的0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%），2 000 r/min斬拌60 s；最后加入剩下的1/2冰水，2 000 r/min斬拌60 s，即得到LCMB。其中，L-賴氨酸及TGase質量分數的選取參考預實驗結果及相關文獻[12]確定。

表1 添加L-賴氨酸和TGase的LCMB配方Table 1 Formulation of low-salt chicken meat batter added with L-lysine and TGase %

1.3.2 LCMB熱誘導凝膠的制備

稱取1.3.1節制得的肉糜置于50 mL聚丙烯離心管中，每管肉糜質量約35 g。將肉糜在4 ℃條件下，500×g離心3 min，去除肉糜中的氣泡，然后于80 ℃水浴鍋中加熱30 min，得到LCMB凝膠。將LCMB凝膠取出后快速放入冰中冷卻10 min，隨后轉移至0～4 ℃冰箱，靜置過夜，用于WHC、質構、水分流動性和分布、微觀結構及蛋白質構象的測定。

1.3.3 WHC測定

參考Guo Xiuxia等[19]的方法，用濾紙吸收雞肉糜凝膠表面水分，取約5 g凝膠樣品（質量記為m1），用濾紙包裹置于50 mL離心管中，1 000×g、4 ℃離心5 min，記錄離心后剩余樣品質量m2。按照下式計算WHC：

1.3.4 質構特性測定

參考Wang Yu等[20]的方法，用平行刀片將雞肉糜凝膠切成高度為2 cm、底面直徑為2.5 cm的圓柱體，使用TA-XT Plus質構分析儀進行質構特性分析。測試參數設置為：P/36R探頭；測試前速率2.0 mm/s；測試速率2.0 mm/s；測試后速率5.0 mm/s；壓縮比50%；自動觸發5.0 g；間隔時間5.0 s。

1.3.5 水分特性測定

參考Zhang Daojiu等[21]的方法，通過NMI20低場核磁共振成像分析儀分析肉糜凝膠內部水分分布特性。將約2 g肉糜凝膠樣品放入直徑15 mm核磁管中，使用CPMG序列進行測試。測試參數如下：測試溫度32 ℃，質子共振頻率22 MHz，90°脈沖和180°脈沖間隔時間200 μs，重復掃描32 次，兩次掃描之間的間隔時間5.0 s，回波數18 000。得到指數衰減圖形，通過SIRT算法反演擬合得到T2譜圖。

1.3.6 微觀結構測定

參考潘杰等[22]的方法，將肉糜凝膠切成2 mm×2 mm×2 mm的立方體，用體積分數4%甲醛和2.5%戊二醛混合溶液（1∶1，V/V）固定2 h；用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）漂洗3 次，每次15 min；用乙醇溶液（30%～100%）和丙酮（100%）溶液脫水，每次各15 min，冷風除去易揮發的有機溶劑；真空冷凍干燥15 h，噴金，用Regulus 8100冷場發射掃描電鏡觀察凝膠的微觀結構，加速電壓3 kV，放大倍數2 000。

1.3.7 蛋白質構象測定

參考康壯麗等[23]的方法，取適量雞肉糜凝膠樣品，置于載玻片上，通過激光顯微共聚焦拉曼光譜儀檢測蛋白質的構象變化。使用以下參數進行測試：激光波長785 nm，焦距鏡頭50 倍，采集次數10 次，曝光時間10 s，光譜波長范圍 400～3 500 cm－1，分辨率2 cm－1。使用Labspec version 5.0軟件對光譜進行基線校正和平滑處理，根據苯丙氨酸1 003 cm－1的譜帶進行光譜的歸一化處理（此峰強度不隨蛋白質結構變化而變化）[24]。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 L-賴氨酸協同TGase處理對LCMB凝膠WHC的影響

WHC大小代表蛋白質網絡捕獲水的能力高低，直接影響肉和肉制品的質量好壞。如圖1所示，對照組（C0）的WHC僅為75%，表明低鹽條件不利于雞肉糜凝膠對水分的保持，這是因為鹽溶性肌原纖維蛋白的溶出較少，難以在加熱過程中產生充分的交聯反應，形成的凝膠結構不穩定，進而增加了水分的流失[20]。TGase對LCMB凝膠的WHC無顯著影響（P＞0.05），這與Shang Yongbiao等[25]的結果一致。TGase對肉制品WHC的影響存在矛盾的結果，其增加/降低豬肉糜凝膠WHC的結果均有報道[11-12]。這些不一致的結果可能與肉的來源、TGase添加量及其作用條件（反應溫度和時間）、肉糜體系其他存在的成分等有關[12]。在添加TGase的情況下，隨著L-賴氨酸添加量由0%增至1%，LCMB凝膠的WHC從75%增至88%。與C0組相比，T3～T5組的WHC顯著增加（P＜0.05），且T3～T5組之間的WHC無顯著差異（P＞0.05）。L-賴氨酸能增強肌原纖維蛋白的溶解，促進肉蛋白結構的展開、變性和聚集，誘導形成致密的凝膠網絡結構，從而提高肉制品的WHC[26-27]。此外，L-賴氨酸還可提高肉體系的pH值，增強蛋白質之間的靜電斥力，提高蛋白質凝膠對水分的束縛能力[15]。Zhu Xiaoxu等[27]在探究L-賴氨酸對乳化雞肉腸WHC的影響時也發現了類似的現象。綜上，本實驗結果表明，0.5% TGase結合L-賴氨酸（質量分數≥0.5%）處理能有效改善LCMB凝膠的WHC，具有改善低鹽肉制品持水特性的潛力。

圖1 L-賴氨酸協同TGase處理對LCMB凝膠WHC的影響Fig.1 Effect of combined treatment of L-lysine nad TGase on the WHC of LCMB gels

2.2 L-賴氨酸協同TGase處理對LCMB凝膠質構特性的影響

由表2可知，與C0組相比，T1組的硬度顯著增加（P＜0.05）。TGase能使肉蛋白形成?-(γ-谷氨酰基)-賴氨酸共價交聯，增強蛋白質分子間作用力，提高凝膠結構的穩定性，從而促進肉制品硬度的提高[28]。另外，TGase處理可促進肉蛋白α-螺旋結構向β-折疊和β-轉角結構轉變，利于良好凝膠結構的形成，從而改善肉制品的質構特性[23]。在TGase存在的情況下，LCMB凝膠的硬度、彈性、內聚性和咀嚼性隨著L-賴氨酸含量的增加呈現升高趨勢，當L-賴氨酸添加量為1%時，LCMB的各項質構參數（硬度除外）均達到最高值。可能的原因有：一方面，L-賴氨酸能促進肉蛋白分子的展開和活性基團的暴露[29]，這可能導致TGase可反應底物數量增加，進而增強TGase對肉蛋白的交聯作用；另一方面，L-賴氨酸能改變肉蛋白的構象，促進形成黏彈性好的凝膠三維網絡結構，利于質構特性的提高[18]。此外，有研究表明，肉制品質構（如硬度、咀嚼性等）與蛋白質含量有關[30]。由于T1～T5組配方中的水分添加量均低于C0組，可起到“濃縮”蛋白質的作用，這也可能是T1～T5組質構特性得到改善的原因。本實驗結果與Guo Xiuxia等[19]的研究不一致，他們發現L-賴氨酸能抑制肌球蛋白的熱聚集，不利于三維凝膠網絡結構的形成，進而導致重組火腿質構的下降。這些不一致的現象可能與賴氨酸添加量、肉制品類型、肉體系的pH值和離子強度等因素有關。

表2 L-賴氨酸協同TGase處理對LCMB凝膠質構特性的影響Table 2 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on textural properties of LCMB gels

2.3 L-賴氨酸協同TGase處理對LCMB凝膠水分特性的影響

由圖2可知，各組LCMB凝膠均呈現4 個T2弛豫時間峰：0.1～1 ms為強結合水（T2a）；1～10 ms為弱結合水（T2b）；10～100 ms為不易流動水（T21）；100～10 000 ms為自由水（T22）[31]。肉糜凝膠持水性的變化能通過不同狀態水分的分布比例反映[32]。LCMB凝膠中不同狀態水分相對含量的變化如表3所示，其中，P2a、P2b、P21、P22分別代表強結合水、弱結合水、不易流動水和自由水的相對含量。由表3可知，TGase對LCMB凝膠P2a、P2b、P21、P22無顯著影響（P＞0.05）。與C0組相比，T2～T5組的P2a和P2b無顯著變化（P＞0.05），P21顯著增加（P＜0.05），而P22顯著降低（P＜0.05），表明L-賴氨酸協同TGase處理能促進LCMB凝膠中自由水向不易流動水轉化。有研究指出，P21的增加和P22的降低能提高肉糜凝膠WHC[33]，這與WHC結果一致。可能是因為L-賴氨酸能提高肉體系的pH值，增加肉蛋白分子間的靜電斥力，進而增強蛋白質-水相互作用[15]。

圖2 L-賴氨酸協同TGase處理對LCMB凝膠水分弛豫時間的影響Fig.2 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on relaxation time of water protons in LCMB gels

表3 L-賴氨酸協同TGase處理對LCMB凝膠不同狀態水分相對含量的影響Table 3 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on relative contents of water in different states in LCMB gels %

2.4 L-賴氨酸協同TGase處理對LCMB凝膠微觀結構的影響

肉制品的WHC和質構特性與其微觀結構有密切聯系[18]。LCMB凝膠的微觀結構通過掃描電鏡觀察，結果如圖3所示。不同處理組的LCMB凝膠微觀結構差異明顯。C0組凝膠疏松，含有大量形狀各異的孔隙。肉糜經過加熱后，蛋白質發生變性使吸附的水分析出，轉變為自由水，在流失的過程中形成大量的“水通道”[34]。因此，這些孔隙應該是水分流失形成的“水通道”。T1組凝膠網絡的交聯程度明顯提高，且孔隙的大小也變小。TGase能催化肉蛋白中的賴氨酸和谷氨酸交聯形成共價鍵，促進形成密實的肉糜凝膠結構[20]。在添加TGase的基礎上，L-賴氨酸能進一步減小LCMB凝膠中的孔隙數量和大小，并提高了凝膠網絡的均勻性、有序性和致密性，這些變化可以通過T2～T4組掃描電鏡圖反映。L-賴氨酸能促進肉蛋白活性基團的暴露，增強蛋白質分子間的相互交聯，從而改善了肉糜凝膠的微觀結構[15]。有研究表明，密實的蛋白質凝膠網絡結構有利于提高肉制品的WHC和質構[35]。因此，L-賴氨酸協同TGase能通過減少LCMB凝膠中“水通道”的產生，促進形成致密、均勻、有序的凝膠網絡結構，從而提高了凝膠的WHC（圖1）和質構特性（表2）。

圖3 LCMB凝膠的掃描電鏡圖（×2 000）Fig.3 Scanning electron microscopic images of LCMB gels (× 2 000)

2.5 L-賴氨酸協同TGase處理對LCMB蛋白質構象的影響

為解析L-賴氨酸協同TGase對LCMB凝膠特性影響的分子機制，通過拉曼光譜分析了肉糜蛋白質構象的變化。如圖4所示，760、830 cm－1和850 cm－1的雙峰以及2 930 cm－1處的拉曼譜峰分別能反映色氨酸殘基、酪氨酸殘基以及脂肪族氨基酸殘基的微環境變化，進而提供蛋白質三級結構的變化信息[33,36-37]。L-賴氨酸及TGase對上述特征拉曼譜峰的歸一化強度影響見表4，與C0組相比，T1組的760 cm－1強度輕微增加（P＞0.05）。在添加TGase的情況下，隨著L-賴氨酸含量的增加，760 cm－1強度呈現下降的趨勢，表明L-賴氨酸能促進肉糜蛋白質色氨酸殘基的暴露[33]，使肉蛋白的微環境更加親水，進而有利于凝膠網絡對水分的截留[38]，最終提高肉制品的WHC。I850/I830比值一般在0.3～2.5范圍內。當I850/I830比值較大（＞0.9）時，表明酪氨酸殘基上的羥基主要暴露于極性水環境。I850/I830比值越高，酚羥基暴露越多，與水分子形成氫鍵；I850/I830比值越低，酚羥基埋藏越多，與相鄰的蛋白質極性基團形成氫鍵[36]。各處理組中的I850/I830均大于0.9，表明肉糜蛋白質中酪氨酸殘基的酚羥基暴露在極性水環境中。與C0組相比，T2～T5組I850/I830有增加的趨勢，說明L-賴氨酸協同TGase能促進酪氨酸殘基的暴露，與水分子形成氫鍵。2 930 cm－1處的拉曼譜峰，代表脂肪族氨基酸殘基CH的伸縮振動。與C0組相比，T2～T5組的I2930/I1003呈現升高的趨勢，表明L-賴氨酸及TGase聯合處理能促進肉蛋白結構的展開，引起脂肪族氨基酸殘基的暴露[37]。拉曼光譜的結果表明，L-賴氨酸協同TGase能促進肉蛋白活性基團的暴露，誘導產生更多的分子間相互作用，從而有利于提高LCMB凝膠的品質。

圖4 L-賴氨酸協同TGase處理下LCMB凝膠的拉曼光譜（700～2 000 cm－1）Fig.4 Raman spectra of LCMB gels added with L-lysine and TGase (700-2 000 cm-1)

表4 L-賴氨酸協同TGase處理對LCMB凝膠歸一化拉曼強度的影響Table 4 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on normalized Raman intensity of LCMB gels

3 結論

L-賴氨酸協同TGase處理可促進LCMB凝膠中自由水向不易流動水轉化，減少LCMB凝膠中“水通道”的產生，誘導形成致密、均勻、有序的凝膠網絡結構，促進肉糜蛋白質中色氨酸殘基、酪氨酸殘基以及脂肪族氨基酸殘基的暴露，增強蛋白質分子間相互作用，從而改善LCMB凝膠的WHC和質構特性。因此，L-賴氨酸與TGase聯合處理是一種有效改善低鹽肉糜凝膠特性的方式，這為高品質低鹽凝膠類肉制品的開發提供了新的解決方案。