基于GC-IMS結合化學計量法分析燒烤過程中溫度對牦牛肉風味物質的影響

張 浩，易宇文，朱開憲，鄧 靜,*，胡金祥，劉 陽，喬明鋒，白 婷

（1.四川旅游學院烹飪學院，四川 成都 610100；2.四川旅游學院 烹飪科學四川省高等學校重點實驗室，四川 成都 610100；3.肉類加工四川省重點實驗室，四川 成都 610106）

西藏是我國牦牛主要養殖省份之一，當雄縣位于西藏自治區中部，屬于高原大陸性氣候，平均海拔4 200 m，擁有大片優質高原草場。當雄牦牛是當地特有牦牛品種[1]，高海拔、草飼、散養養殖環境使當雄牦牛肉具有色澤深紅、質地較硬、蛋白質含量高的特點[2]，由于生長周期長，其肉質更有嚼勁，適合燒烤加工。牛肉中的糖類化合物包括糖原、葡萄糖、麥芽糖和核糖等，這些物質是牛肉受熱發生美拉德反應的主要底物。燒烤作為最原始的烹飪方法，其烹飪過程中蛋白質分解產生游離氨基酸并與糖發生美拉德反應，從而產生風味物質[3]，這些風味物質是消費者喜愛燒烤的原因。消費者追求燒烤帶來的香味和色澤，同時燒烤的高溫會導致人體有害物質的產生[4]，因此，尋找滿足美味與食品安全的適當燒烤溫度十分重要。

目前國內外的研究大多集中在美拉德反應的條件和底物方面。例如，劉森軒[5]基于牛肉酶解和定向美拉德反應制備烤牛肉風味物質；Bai Shuang等[6]研究認為炒制時間是臊子香氣化合物變化的主要因素；張杰等[7]研究加熱溫度影響牦牛肉肌原纖維蛋白與葡萄糖或果糖美拉德反應揮發性成分；劉雅娜等[8]研究認為180 ℃烤制羊肉風味最佳；徐永霞等[9]基于氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）技術和化學計量學分析海鱸魚肉蒸制過程中風味物質的變化；劉俊霞等[10]使用GC-IMS結合化學計量學分析大鯢肉冷藏期間揮發性成分。然而，關于牦牛肉燒烤過程中溫度變化對風味物質的影響鮮見報道。

GC-IMS是一種新興檢測技術，結合氣相色譜和離子遷移譜技術，可以對化合物進行可視化分析，其靈敏度高、響應快、無需預處理、穩定性好，能檢測出小分子、低含量化合物[11]；感官評價是食品風味鑒別中最常見、簡單的方法；利用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）、化合物感官閾值分析風味化合物；融合分析可以從風味、色澤、氣味上進行綜合比較分析。

本研究以西藏當雄牦牛腿肉為對象，分別使用60、120、180、240、300 ℃萬能蒸烤箱燒烤模式，采用GC-IMS結合感官評價、ROAV、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、主成分分析（principal component analysis，PCA），解析燒烤過程中化合物變化及風味變化特征，旨在為風味機理形成研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

當雄牦牛肉后腿肉（半膜肌），產自當雄縣，海拔4 300 m，草飼、散養，3 齡公牛，屠宰后經48 h排酸，－195.8 ℃液氮冷凍包裝，空運到實驗室，解凍到常溫25 ℃。

正酮（C4～C9，色譜純）國藥集團化學試劑（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

Flavour Spec?GC-IMS儀 德國G.S.A公司；FOX4000電子鼻 法國Alpha MOS公司；CMP61G型萬能蒸烤箱 德國RATIONAL公司；S20 mL頂空瓶 北京譜朋科技有限公司；BT423S型電子天平 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將解凍至常溫25 ℃的半膜肌剔除筋膜和脂肪，分割成3 cm×4 cm×4 cm長方塊，均勻撒少量食鹽（便于化合物揮發），腌制15 min后，編號B～F組分別放入60、120、180、240、300 ℃的萬能蒸烤箱，使用燒烤模式烤制7 min；出爐后立即檢測牛肉外表溫度、中心溫度、拍照記錄、嗅聞氣味、稱質量，完成感官評價；再取一塊生肉作為參照組樣品（A組）。烤制時間、溫度、牛肉大小、質量是根據前期多次預實驗結果確定。

1.3.2 感官評價

由5 位烹飪行業專家、5 位接受過食品感官評價課程培訓的西餐專業同學組成評定小組，參考GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評定規范標準》共同制定評價標準（表1），然后在專業品評實驗室開展感官評價。

表1 燒烤牦牛肉感官評分標準Table 1 Criteria for sensory quality of roasted yak meat

1.3.3 失水率測定

按式（1）計算失水率：

式中：m1為烤制后樣品質量/g；m2為烤制后樣品質量/g。

1.3.4 GC-IMS分析

參考師希雄等[12]的研究方法，將6 個樣品剁細后，分別精確稱量4.0 g，置于20 mL頂空瓶（IMS專用瓶）中，加裝蓋子、墊圈、旋緊瓶蓋，編號待檢；每個樣品平行3 次。

進樣條件：設置孵育溫度60 ℃，孵育15 min；進樣針溫度65 ℃，頂空自動進樣500 μL，轉速500 r/min。

分析條件：使用MXT-5金屬毛細管氣相色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm），色譜柱溫度60 ℃。載氣為N2（純度≥99.999%）。載氣流速程序：初始流速2 mL/min，保持2 min，18 min內流速勻速升至100 mL/min，保持100 mL/min至30 min；漂移氣流速保持150 mL/min；IMS溫度45 ℃；記錄揮發性化合物的保留指數（retention index，RI），將RI和漂移時間與GC×IMS庫中信息進行對比定性。

數據分析：利用Flavor Spec風味分析儀配備的分析插件進行風味物質圖譜分析，使用GC×IMS Library Search軟件內置的NIST數據庫和IMS數據庫對風味物質進行定性分析。

1.3.5 ROAV計算

ROAV是一種結合閾值判定化合物重要性的方法，其原理及計算方法參考文獻[13-14]，如式（2）所示：

式中：Cstan為最大化合物相對含量/%；Tstan為最大化合物閾值/（μg/kg）；Ci為某種化合物相對含量/%；Ti為某種揮發性化合物閾值/（μg/kg）。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 不同溫度條件燒烤牦牛肉感官評價結果

感官評價是食品檢測最簡單、便捷的方法，由表2、3可知，除去對照組A樣品生肉，其余5 個樣品經過7 min燒烤后，表面溫度和中心溫度均呈現較大變化，樣品失水率為21%～46%，顏色差異明顯。于亞輝等[15]研究認為溫度140 ℃以上或反應時間過長時，發生焦糖化反應，糖分子裂解產生醛類、酮類物質的同時脫水形成焦糖色，使產品具有特殊的色澤與風味。溫度和時間是影響美拉德反應褐變的關鍵，本研究在180 ℃出現明顯褐變，且大量汁水滲出，這是由于香味前體物質、水溶性蛋白質和脂肪溶解導致。王吉等[16]研究認為肉類特殊風味很大程度取決于脂質加熱后產生的揮發性物質，本實驗在燒烤溫度240 ℃獲得脂質降解產生的牛肉香味，且樣品中滲出大量帶有油脂的透明汁水。以上結果表明，燒烤過程中受到樣品質量、水分含量、時間和溫度多重因素影響，對于短時間內必須完成的燒烤過程，可以通過調整燒烤溫度控制燒烤的質量。感官評價結果表明：E＞F＞D＞C＞B＞A，表明烤制時間7 min時，最優燒烤溫度為240 ℃。

表2 不同燒烤溫度對牦牛肉失水率的影響Table 2 Effects of different roasting temperatures on water loss rate of yak meat

表3 不同燒烤溫度下牦牛肉感官評價結果Table 3 Sensory evaluation results of roasted yak meat

2.2 GC-IMS分析結果

2.2.1 不同溫度燒烤過程揮發性物質差異

GC-IMS 二維圖譜中紅色垂直線為反應離子峰（reaction ion peak，RIP），RIP兩側的每個點代表一種化合物，紅色代表該化合物含量較高，藍色代表含量較低[17-18]。如圖1所示，明顯可見不同燒烤溫度下樣品RIP強度差異較大，且隨溫度升高化合物種類先增加后逐步減少，表明不同溫度下燒烤過程產生的化合物變化差異較大。化合物漂移時間在1.0～8.0 ms完成，保留時間在100～1 500 s完成；樣品A在漂移1.5 ms完成，且對應顏色點較少，顏色較淺，說明化合物含量不高；與樣品A相比，樣品C、D、E化合物種類和含量均增加明顯，樣品F則明顯大幅減少，保留時間也縮短至1 300 s左右。總的來看，樣品A化合物含量較低，樣品B、C、D化合物含量呈明顯逐步增加趨勢，樣品F含量大幅減少。

圖1 不同溫度燒烤牦牛肉GC-IMS二維圖譜Fig.1 Two-dimensional GC-IMS maps of yak meat roasted at different temperatures

為進一步了解揮發性化合物在牦牛肉燒烤過程中的變化趨勢及差異性，采用儀器自帶的Gallery Plot插件生成可視化指紋圖譜。結果如圖2所示，每一列代表化合物在不同樣品中的相對含量，紅色越深代表離子流信號強度大，面積越大代表濃度越高[19]，反之則小。按照化合物變化趨勢劃分為6 個區域進行分析。

圖2 燒烤過程中牦牛肉揮發性化合物指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of volatile compounds in roasted yak meat

一區中，樣品A、B、C、D、E中化合物含量呈逐漸升高趨勢，在樣品F（燒烤溫度300 ℃）中化合物急劇下降。表明燒烤溫度在180～240 ℃區間化合物含量逐漸達到最高，而溫度達到300 ℃時反而急劇減少，其中，1-戊烯-3-醇、月桂烯、苯乙酮、4-己烯-1-醇、正戊醇含量變化較大。有研究表明醇類、醚類和烴類共同構成牛肉風味[20]，這一區域多種醇類化合物能賦予牦牛肉芳香和果香味。二區中，樣品化合物含量隨溫度升高而升高，當溫度為240 ℃，樣品E化合物濃度最高，特別是乳酸丁酯和乙酸乙酯。這兩種脂類在樣品A中含量均較少，隨溫度不斷升高而增大，燒烤后牦牛肉具有果香味和朗姆酒甜香回味可能與此有關。三區中，樣品A、B、C化合物含量均較低，而樣品D、E、F則較高，表明當溫度在180～300 ℃時化合物含量逐步增大，變化較大的為乙酸丙酮、3-甲硫基丙醛（D）、3-甲基-2-丁烯醛、2-丁酮（D）、2,4,6-三甲基吡啶、乙酸甲酯、丁位己內酯、丙位辛內酯，大多是羰基化合物（源于糖類或油脂氧化后產生的醛類或酮類物質[21]）也是美拉德反應重要部分。

四區中，樣品A、B化合物含量較低，而樣品C、D、E化合物含量達到最高，樣品F（燒烤溫度300 ℃）未檢測到這些物質或含量極低，主要為反-2,4-庚二烯醛、α-水芹烯、正丁醇（D）、2-甲基吡嗪。

五區中，樣品E（240 ℃）化合物含量明顯高于其他樣品，樣品F（燒烤溫度300 ℃）急劇減少，主要為2-乙基-6-甲基吡嗪、正己酸乙酯、吡啶、香芹酮、2-甲氧基-4-甲基苯酚、6-乙基四氫-2H-吡喃-2-酮、丙位庚內酯、5-壬酮、對二甲苯、2-甲基-3-羥基-4-吡喃酮、苯酸甲酯、1-戊烯-3-酮、庚酸甲酯、2-甲基-1-戊醇、水楊酸乙酯、(Z)-4-癸烯醛、2-糠酸甲酯、γ-丁內酯、3-甲硫基丙醇、糠醛。氨基化合物（游離氨基酸、肽類等）發生反應，產生醛、酮、醇、呋喃、吡啶、吡嗪、噻唑、噻吩、咪唑及含氮或硫雜環化合物[22]，這一區域多為酮類、雜環類等對肉類風味影響較大的化合物。酚類物質主要呈現焦香、煙熏味，其閾值較低，對風味貢獻較大[22]，實驗中檢測出2-甲氧基-4-甲基苯酚（愈創木酚），呈煙熏風味，說明當燒烤溫度達到240 ℃時，樣品E燒烤特殊的煙熏風味最強。六區中，樣品A、B、C、D、E化合物含量均較低，而樣品F（燒烤溫度300 ℃）中這一區域化合物含量明顯增加，主要為二乙二醇二甲醚、5-甲基呋喃醛、環戊酮、3-甲硫基丙酸乙酯、異丁醛。

綜上，當燒烤溫度到達240 ℃時，樣品E化合物含量最高，且燒烤特有的煙熏風味最強，其次是180 ℃時（樣品D），其化合物含量較高，但是當溫度達到300 ℃時（樣品F），化合物含量急劇減少。揮發性化合物含量并不能完全解釋肉類的風味，肉類風味還與其風味閾值有關[23]，需要進一步進行ROAV分析。

2.2.2 揮發性化合物GC-IMS定性分析

如表4所示，燒烤過程中牦牛肉揮發性化合物共檢測出82 種，包括醛類15 種、醇類12 種、脂類24 種、酮類14 種、雜環類7 種、烯烴類3 種、其他類化合物7 種；其中，3-甲硫基丙醛、正丁醇、2-丁酮為二聚體。使用歸一法計算GC-IMS鑒定出的化合物的相對含量，如圖3所示，燒烤牦牛肉中醛類相對含量14.2%～20.6%、醇類相對含量9.9%～12.1%、脂類相對含量22.1%～27.2%、酮類相對含量22.19%～30.3%、雜環類相對含量9%～11.8%、烯烴類相對含量4.3%～6.4%、其他類相對含量3.5%～5%。對肉類香味影響較大的酮類化合物含量隨溫度升高而增加，到一定溫度后隨之減少，這可能是受到脂肪氧化降解的影響；醇類與脂肪酸發生酯化形成酯類物質[24]，這可能是燒烤牦牛肉脂類種類較多和相對含量較大的主要原因；雜環類化合物相對含量較低，對肉類風味影響較小，也隨燒烤溫度明顯變化。以上結果表明，燒烤溫度變化對化合物相對含量影響較大，且十分復雜。

圖3 燒烤牦牛肉化合物相對含量變化圖Fig.3 Change in relative contents of volatile compounds in roasted yak meat

表4 燒烤牦牛肉鑒定出的揮發性化合物Table 4 Volatile compounds identified from roasted yak meat

2.2.3 PLS-DA結果

PLS-DA是有監督模式統計分析方法，將數據進行降維，實現復雜數據可視化及判別分析和預測[27]。如圖4所示，以揮發性化合物相對含量為自變量（X），ROAV為因變量（Y），隨機改變分類變量的排列順序建立相應的模型，R2X=0.691，R2Y=0.994，Q2=0.975，當R2和Q2在0.5～1.0之間時，說明模型具有較好的解釋和預測能力[28]，可以用于區分化合物差異，再進行置換檢驗，R2=（0.0，0.427），Q2=（0.0，－0.291），共2 組模型進行擬合驗證，R2均位于X軸上方，Q2為負數，說明該模型可靠，不存在過擬合現象，模型相關性較好[29]。

圖4 燒烤牦牛肉PLS-DA得分圖（A）和驗證圖（B）Fig.4 PLS-DA score plot (A) and permutation test (B) of roasted yak meat

經PLS-DA模型分析得到變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，再計算VIP＞1的化合物ROAV[30]，當化合物ROAV＞1時，其對樣品風味有貢獻，定義為影響風味的關鍵化合物[31]。如圖5和表5所示，燒烤過程中牦牛肉風味關鍵化合物為乳酸乙酯、2-甲氧基-4-甲基苯酚、2-乙酰基-1-吡咯啉、5-壬酮、水楊酸乙酯、1-丙醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛、1-戊烯-3-酮、(E)-2-庚烯醛、乙酸芳樟酯、正丁醇（D）、3-甲硫基丙醛（M）、2-乙基-6-甲基吡嗪、4-己烯-1-醇、(Z)-4-癸烯醛、反-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、異丁酸乙酯等，共計18 種；其中，3-甲硫基丙醛（M）、2-乙酰基-1-吡咯啉ROAV＞10 000，說明在燒烤過程中對風味變化影響最大。

圖5 燒烤牦牛肉中揮發性化合物的VIP值Fig.5 VIP values of volatile compounds in roasted yak meat

表5 燒烤牦牛肉中關鍵風味化合物的ROAVTable 5 ROAVs of key flavor compounds in roasted yak meat

2.2.4 燒烤牦牛肉關鍵化合物PCA結果

由圖6可知，PC1貢獻率為46.66%，PC2貢獻率為34.79%，兩者累計貢獻率大于80%，可以代表化合物大部分信息[32]。PC雙標圖中樣品E最靠近X軸，其次是樣品B、C、D，樣品F遠離X軸，說明其風味區別于其他樣品；對照組樣品A為生肉，與燒烤后的牦牛肉相比表現出較大差異。與樣品B靠近的乳酸乙酯呈濃郁的酒味，1-戊烯-3-酮呈蘑菇和金屬氣味，2-乙酰基-1-吡咯啉呈爆米花香，這些呈香物質與其他呈香物質混合可能會產生令人不愉快的氣味。樣品C、D相關的2-乙基-6-甲基吡嗪和2-甲氧基-4-甲基苯酚賦予樣品堅果、烘焙的甜香氣和煙熏風味、芳香味；與樣品E相關的(E)-2-庚烯醛呈脂肪香氣、正丁醇（D）呈酒精芳香味、反-2,4-庚二烯醛、乙酸芳樟酯賦予樣品令人愉快的花香和果香；與樣品F相關的3-甲硫基丙醛（M）賦予樣品洋蔥、肉香味；1-丙醇帶有酒香氣；異丁酸乙酯賦予果香。

圖6 燒烤牦牛肉關鍵化合物PCA雙標圖Fig.6 PCA biplots of key flavor compounds in roasted yak meat

結合感官評價，樣品E風味最佳，具有烤肉香味、脂肪香氣和花果氣味；樣品C、D次之，具有堅果、烤面包的甜香氣味和煙熏風味；樣品A位于第3象限風味較差。

3 結論

采用感官評價、GC-IMS結合ROAV、PLS-DA、PCA評價不同溫度燒烤牦牛肉中氣味物質的變化。感官評分依次為樣品E＞F＞D＞C＞B＞A，烤制時間為7 min時，最優燒烤溫度為240 ℃。GC-IMS共鑒定出82 種揮發性化合物，包括醛類15 種、醇類12 種、脂類24 種、酮類14 種、雜環類7 種、烯烴類3 種、其他類化合物7 種；當燒烤溫度到達240 ℃時，樣品E化合物含量最高，且燒烤特有的煙熏風味含量最大；其次是樣品D、C，當溫度到達300 ℃時樣品F化合物含量急劇降低。ROAV分析表明，乳酸乙酯、2-甲氧基-4-甲基苯酚、2-乙酰基-1-吡咯啉、5-壬酮、水楊酸乙酯、1-丙醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛、1-戊烯-3-酮、(E)-2-庚烯醛、乙酸芳樟酯、正丁醇（D）、3-甲硫基丙醛（M）、2-乙基-6-甲基吡嗪、4-己烯-1-醇、(Z)-4-癸烯醛、反-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、異丁酸乙酯這18 種化合物是燒烤牦牛肉關鍵風味化合物。實驗結果表明，樣品E風味最佳，呈烤肉香味、脂肪香氣和花果氣味；樣品C、D次之，呈堅果、烤面包的甜香氣味和煙熏風味。樣品B雖然靠近X軸，氣味濃郁，但風味較差。研究結果對后續風味形成機理提供一定理論參考。