骨質疏松癥的骨免疫機制及中藥單體干預研究*

謝希,高曦,婁宏君,石曄,甘廣,馬欣瑋,李豐杉

1.黑龍江中醫藥大學第一臨床醫學院,黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,黑龍江 哈爾濱 150040; 3.湖南中醫藥大學中西醫結合學院,湖南 長沙 410208

骨質疏松癥是一種以骨量減少、骨微結構破壞、骨硬度降低并伴隨著骨折風險增加為主要特征的運動系統疾病[1]。與同性別、同種族的成人相比,骨密度降低程度≥2.5個標準差即可診斷為骨質疏松癥[2]。最新流行病學調查顯示,我國50歲以上人群中骨質疏松癥患病率為19.2%,其中男性患病率為6%,而女性患病率為32.1%,是骨質疏松癥的高發人群[3]。防治骨質疏松癥是落實《“健康中國2030”規劃綱要》的重要一環,已經成為了全社會的健康共識。骨質疏松癥的危險因素有超重、吸煙、飲酒、糖皮質激素等藥物的攝入和長時間制動等,常與糖尿病和庫欣綜合征等疾病并見,目前對于該病的防治主要是補充維生素D、鈣劑、雙磷酸鹽、降血鈣素、甲狀旁腺素和雌激素等[4]。骨的新陳代謝依賴于成骨細胞和破骨細胞的動態平衡,當破骨細胞過于活躍時,骨量減少,從而引起骨質疏松癥等一系列疾病。骨與免疫系統關系密切,骨髓可以產生免疫細胞,但免疫系統對于骨的調控研究較少,2000年,Arron等[5]正式提出“骨免疫學”概念,免疫系統與骨的“互動”已成為近年研究的熱點,也為骨質疏松癥的防治提供了新的思路和方法。隨著骨免疫學的發展和對中醫藥治療骨質疏松癥研究的深入,發現相當多的中藥單體均可以通過調控骨骼和免疫系統實現對骨質疏松癥的干預,為骨質疏松癥的防治提供了新的思路。本研究對骨免疫在骨質疏松的作用機制、中藥單體對骨質疏松癥免疫性調控的研究進行綜述,以期為中醫藥防治骨質疏松癥提供新的思路和見解。

1 骨質疏松癥骨免疫機制研究進展

1.1 骨質疏松癥與骨保護素(osteoprotegerin,OPG)/NF-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)/NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)系統OPG/RANK/RANKL均屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)家族,該系統的闡明為骨骼系統與免疫系統的“對話”提供了可能性。OPG基因最初是在對胎鼠腸道cDNA的測序過程中發現的[6],其定位在染色體的8q23-24位置,可編碼一個含401個氨基酸的缺乏跨膜結構域的分泌性糖蛋白,OPG蛋白在細胞內以55 kD分子量大小合成,然后以110 kD二聚體形式被分泌到細胞外。同年,來自日本的科學家在人胚胎肺成纖維細胞的條件培養基發現了一種能抑制破骨細胞生成的因子,并將其命名為破骨細胞生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF)[7]。通過對二者的cDNA序列進行分析比較,發現OCIF即OPG[8]。RANK基因是通過對樹突狀細胞(dendritic cells,DC)的cDNA文庫直接測序鑒別發現的[9],并通過直接表達篩選出其配體RANKL,RANK基因定位于人類染色體的18q22.1位置,編碼一個含616個氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白,RANKL基因定位于13q14位置,編碼一個含316個氨基酸的Ⅱ型跨膜蛋白。在骨骼系統中,成骨細胞合成并分泌RANKL和OPG,破骨前體細胞表達RANK,RANKL可與RANK結合,刺激破骨前體細胞分化成破骨細胞,促進骨吸收,而OPG則可作為誘餌受體競爭性地與RANKL結合,延緩破骨前體細胞的分化成熟,從而抑制骨吸收[10-11]。見圖1。

圖1 OPG/RANK/RANKL系統調節骨代謝示意圖

1.2 骨質疏松癥與免疫細胞

1.2.1 T細胞T細胞是調節細胞免疫的主要細胞。RANK作為來自DC的腫瘤壞死因子受體家族成員,其配體RANKL可以增強DC刺激T細胞增殖的能力,并可以增加白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)產生的RANK+ T細胞的活性,提示RANK/RANKL是T細胞和DC之間重要的調節因子[9]。進一步研究發現,RANK在DC中高度表達,RANKL增強DC介導的T細胞增殖,RANKL可以在體外抑制DC的凋亡[12]。活化的T細胞分泌RANKL可以調節破骨細胞的生成以及成熟破骨細胞的活性[13]。在卵巢切除小鼠模型中,通過靶向TNF-α受體P55可以介導T細胞增加TNF-α,進而促進巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)和RANKL誘導的破骨細胞增加;但在缺乏T細胞的模型中并未觀察到該效應,提示T細胞在骨代謝中的潛在重要性[14]。糖皮質激素無法在缺少T細胞的免疫缺陷小鼠誘導產生骨質疏松癥模型,從野生型小鼠移植得到T細胞后,這些T細胞趨向骨髓,表達高水平的RANKL,可以重建骨質疏松癥模型[15]。

1.2.2 B細胞B細胞在人體內主要負責免疫球蛋白的產生和參與體液免疫,與T細胞共同形成適應性免疫系統,同時B細胞與骨代謝也存在著諸多聯系。B細胞是骨髓微環境中OPG的重要來源,缺乏B細胞的小鼠表現出骨質疏松癥,重建B細胞可以逆轉這一表型[16]。牙周病患者的牙齦組織中有大量T細胞和B細胞表達RANKL,從患者牙齦組織中分離出來的B細胞在體外誘導破骨細胞分化形成,而外周血中的淋巴細胞并無此效應,提示活化的B細胞可能是導致牙周病骨吸收的RANKL的來源[17]。人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染后可誘發骨質疏松癥,臨床研究顯示,HIV患者骨吸收顯著增加,表達RANKL的B細胞增加,而表達OPG的B細胞減少,導致破骨細胞增多,提示骨丟失加速與B細胞功能障礙有關[18]。未成熟B細胞占總B細胞比例增加,使HIV感染者B細胞中RANKL/OPG的比值增大,導致骨丟失,提示未成熟B細胞或是篩查骨質疏松癥的新的生物標志物[19]。

1.3 骨質疏松癥與細胞因子

1.3.1 TNF-αTNF-α主要介導炎癥的發生,在急性炎癥反應、自身免疫性疾病和慢性炎癥反應過程中均發揮相應的作用。研究發現,TNF-α在骨吸收的病理生理過程中發揮重要作用[20]。TNF-α 可以誘導破骨細胞分化,該作用不依賴于RANK/RANKL通路,TNF-α招募TNF受體相關因子(TNF receptor related factors,TRAFs),依次激活轉錄因子NF-κB、P50、P52和c-Fos,然后轉錄因子活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT),促進破骨細胞分化[21]。在卵巢切除小鼠中,腸道內的總T細胞、TNF+T細胞和輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)向骨髓歸巢,釋放TNF-α、RANKL和IL-17等細胞因子,從而導致骨流失[22]。一項臨床研究對絕經后骨質疏松患者進行為期兩年的隨訪發現,與健康組比較,絕經后骨質疏松患者血清TNF-α水平顯著升高[23]。

1.3.2 IL-17IL-17主要由Th17細胞分泌,參與炎癥和自身免疫性疾病等病理生理過程。研究發現,IL-17介導IL-34誘導的類風濕關節炎患者成纖維細胞樣滑膜細胞和外周單核細胞RANKL/OPG比例升高,加重了骨破壞,而IL-17抑制劑可以減輕這種效應,提示IL-17是調控RANKL/OPG的潛在靶點[24]。糖尿病可以誘導小鼠口腔炎癥、牙齒骨質流失以及口腔微生物群數量的減少,口腔菌群是導致牙齒骨質流失的重要因素,而IL-17抑制劑可以降低糖尿病小鼠口腔微生物的致病性,減輕牙周骨的損傷程度[25]。當共培養體系中成骨細胞和破骨細胞比例為201時,低劑量的IL-17能夠顯著促進體系中破骨細胞的生成,高劑量的IL-17卻能夠抑制破骨細胞生成,同樣,高水平的IL-17可促進RAW264.7來源的破骨細胞前體細胞的凋亡,但低水平的IL-17表現出抗凋亡功能,Beclin1/TAB3/ERK信號通路介導了這一過程,提示IL-17對于破骨細胞的形成具有“雙刃劍”作用[26-27]。

1.3.3 TGF-βTGF-β是一種多功能的細胞因子,可通過與其Ⅰ型和Ⅱ型受體結合發揮多種生物學作用。早期研究發現,分離出的無基質的單核細胞/巨噬細胞樣造血細胞表達TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體,在外源性TGF-β的刺激下可促進其分化為破骨細胞,且表現出劑量效應關系[28]。TGF-β通過激活絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinase,p38MAPK)促進破骨細胞的生成,而持續暴露于TGF-β則會下調RANKL的表達,減弱RANK/RANKL信號,從而抑制破骨細胞的生成[29]。最近,有研究揭示了不同于RANK/RANKL信號的促進破骨分化的途徑,在TGF-β干預下,巨噬細胞對于TNF-α的刺激由炎癥反應轉化為促進破骨細胞生成的效應,在缺乏TGF-β信號的情況下該效應受到抑制,而一種新的細胞因子B-Myb介導了該效應[30]。

2 中醫藥參與骨免疫防治骨質疏松癥研究進展

2.1 中醫對骨質疏松癥的認識中醫學中無“骨質疏松癥”的病名,根據其特點可歸屬于“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇,其病因多為先天稟賦不足、后天攝養失調和外邪侵襲等,導致臟腑陰陽氣血失調、氣血經脈痹阻、骨失滋養、骨枯髓減從而為病,根本病機為腎精虧虛。根據該病臨床表現和病因病機的不同,可將其分為腎陽虛證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證、腎虛血瘀證、脾胃虛弱證、血瘀氣滯證[31]。隨著對中藥藥理學作用的深入研究,很多中藥被發現具有抗骨質疏松效應和機制,如研究廣泛的補腎類中藥淫羊藿、杜仲、牛膝等,均具有改善骨密度的作用,揭示了“腎主骨”的現代醫學內涵,對于深化中醫理論的研究具有積極意義[32-33]。

2.2 中藥單體調節骨質疏松癥骨疫的研究進展白藜蘆醇屬于非黃酮類多酚化合物,是很多植物受到刺激時產生的一種抗毒素。現代藥理學研究發現,白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗炎、神經保護、抗細菌等作用[34]。有研究發現,白藜蘆醇可以通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)/蛋白激酶B信號通路,上調叉頭轉錄因子(forkhead box O1,FoxO1)的轉錄活性,發揮抗氧化應激作用,并抑制破骨細胞的生成[35]。此外,白藜蘆醇還能促進過氧化氫處理過的成骨細胞的增殖分化,抑制其凋亡[36]。運用固體脂質納米粒改善白藜蘆醇的水溶性,提高其生物利用度,促進骨髓間充質干細胞的成骨效應,為白藜蘆醇的臨床運用和相關藥物研發提供了新的思路[37]。

淫羊藿是一種應用廣泛的補腎類中藥,可提取出淫羊藿苷、淫羊藿次苷和淫羊藿素等多種生物活性物質。淫羊藿苷與OPG具有較強的親和力,能夠提高斑馬魚和去卵巢大鼠的骨密度、OPG水平,降低RANKL水平[38]。Ⅰ型膠原在骨基質中含量豐富,膠原蛋白Ⅰ型α2鏈(collagen type I alpha 2 chain,COL1A2)對骨形成至關重要,淫羊藿苷可以通過提高COL1A2水平、降低骨吸收標志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acidphosphatase 5b,TRAP5b)水平,促進卵巢切除大鼠骨質疏松癥后骨折模型的骨形成[39]。研究發現,淫羊藿苷還可以通過降低RANKL/OPG的比例,抑制肺癌的骨轉移,減輕其導致的溶骨性骨破壞[40]。朝藿定A和朝藿定C都是提取自淫羊藿的黃酮類化合物,朝藿定A可促進骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞,提高OPG/RANKL比例,發揮骨保護作用[41],朝藿定C可提高去勢誘導的雄性骨質疏松小鼠Ⅰ型前膠原N端肽(N-terminal propeptide of typeⅠprocollagen,PⅠNP)和OPG水平、骨小梁數量、骨小梁連接密度,降低骨微結構的各向異性程度[42]。

丁香苷是從刺五加根莖中提取出的一種酚苷類化合物,能夠顯著改善卵巢切除小鼠的骨密度、骨最大負荷和骨小梁微架構,這種效應表現為骨礦物質含量、組織礦物質含量、組織礦物質密度、骨小梁厚度和小梁數量增加,其機制與腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor-necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)、NF-κB和RANKL水平的下調以及OPG、PI3K/AKT水平的升高有關[43]。

桑根酮C是一種黃酮類化合物,在中藥桑白皮中含量豐富,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤的藥理學作用[44]。據報道,桑根酮C治療骨質疏松癥具有一定的潛力,能夠促進小鼠胚胎成骨細胞的增殖,提高堿性磷酸蛋白酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,上調矮小相關轉錄因子(runt-related transcription factor 2,Runx2)、I型膠原表達。此外,還能升高 OPG/RANKL比值,抑制破骨細胞形成,體現在表達TRAP的多核細胞數目減少,骨吸收凹陷面積減少。體內研究表明,桑根酮C能夠逆轉由強的松導致的骨丟失[45]。

佛手苷是從蛇床子中提取出的一種香豆素衍生物,在體外能夠抑制骨髓巨噬細胞和RAW264.7細胞分化為破骨細胞,主要是通過特異性抑制RANKL誘導的NF-κB和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase,JNK)信號傳導實現的。體內研究發現,佛手苷能夠抑制破骨細胞相關轉錄因子活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)和c-fos的表達,這揭示了佛手苷治療骨質疏松癥的潛在機制[45]。

小檗堿又稱黃連素,是從黃連中提取出的具有多種藥理學作用的有效活性成分,對神經系統、泌尿系統、心血管系統等均具有保護作用[46]。在脂多糖誘導的小鼠骨丟失模型中,經小檗堿處理后,骨小梁數量和體積顯著增加,TRAP陽性破骨細胞數量顯著減少,為小檗堿治療骨質疏松癥提供了依據[47]。小檗堿抗骨質疏松的作用機制與p38MAPK、Wnt/β-catenin、腺苷酸激活蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、RANK/RANKL/OPG、PI3K/Akt、NFAT、NF-κB和氧化應激信號傳導有關[48]。

阿克替苷是肉蓯蓉的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、保護神經系統和心血管系統以及骨骼系統的作用[49],可通過RANKL/RANK/TRAF6介導的 NF-κB失活和激活PI3K/AKT阻止去卵巢小鼠的骨丟失[50]。

特女貞苷作為女貞子內含量較高的環烯醚萜苷類成分,是女貞子質量控制的含量測定指標[51]。骨質疏松癥是糖尿病的慢性并發癥,特女貞苷可通過抑制RANKL從而誘導破骨細胞形成,其作用機制與抑制NF-κB和MAPK信號通路的激活有關[52]。

杜仲具有補肝腎、強筋骨、安胎的功效,主治肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈目眩、妊娠漏血、胎動不安。松脂醇二葡萄糖苷作為杜仲質量控制的測定指標,能夠顯著提高青年大鼠股骨和椎骨的骨密度,提高松質骨骨小梁密度和數目、血清OPG水平、骨組織內骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、Runx-2、成骨細胞特異性轉錄因子(osterix,Osx)水平,降低RANKL水平,提示松脂醇二葡萄糖苷是潛在的抗骨質疏松癥的有效物質[53]。

吳茱萸次堿作為一種吲哚喹唑啉類生物堿,提取自吳茱萸,具有抗氧化應激、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等作用[54-56]。吳茱萸次堿在保護骨組織方面也表現出較大潛力,能夠顯著抑制RANKL誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7向破骨分化,促進去卵巢大鼠骨形成,減少骨量丟失[57]。

補骨脂具有補腎壯陽、固精縮尿、溫脾止瀉等功效,現代藥理學研究發現其具有抗炎、抗腫瘤、抗骨質疏松等作用[58]。異補骨脂素是補骨脂中主要的香豆素類成分,研究發現,在去卵巢大鼠模型中,異補骨脂素能夠顯著改善全身、股骨和腰椎的骨密度,提高骨鈣素、降低RANKL/OPG的比例,這或是異補骨質素發揮抗骨質疏松作用的潛在機制[59]。

3 結語與展望

OPG/RANK/RANKL系統的發現對于擴展骨代謝的途徑,加強免疫系統與骨骼系統的聯系具有重要作用,基于OPG/RANK/RANKL系統及其下游信號通路調節骨代謝、抗骨質疏松癥的研究已經十分廣泛,有相當多的中藥單體對于骨質疏松癥有良好的治療作用,大多數中藥單體都是通過干預OPG/RANK/RANKL系統及其下游信號通路,抑制破骨細胞分化和形成,從而發揮抗骨質疏松癥的作用,這對于闡明中藥單體抗骨質疏松癥的機制具有重要意義。但目前對于OPG/RANK/RANKL系統以及中藥單體調控該系統實現對骨質疏松癥治療的研究存在一定的局限性:(1)現有研究著重于中藥單體對OPG和RANKL水平的調節,通過對二者比例的調控實現對破骨細胞分化的干預,但中藥單體直接作用于成骨細胞形成和分化的研究較少,中藥單體是否可以通過增加成骨細胞的形成和活性實現抗骨質疏松效應,如果可以,又是通過哪些途徑實現的,尚未明確;(2)T細胞可以分泌RANKL,巨噬細胞可以分泌OPG,目前的研究較少關注中藥單體調節免疫細胞發揮抗骨質疏松效應,使得中藥單體在骨與免疫系統“對話”中的作用不夠突出;(3)中藥單體是否可以通過其他信號通路或途徑干預骨質疏松癥,它們與OPG/RANK/RANKL系統之間有何關系,能否相互調控有待進一步探討。近年來,外泌體憑借其在細胞通訊中發揮的重要作用受到廣泛關注,有研究發現,利用外泌體搭載山藥有效成分靶向成骨細胞可以促進其增殖分化,從而改善卵巢切除模型的骨代謝狀況,增加骨密度。隨著對外泌體生物學功能的深入研究,骨細胞與免疫細胞的“對話”會得到充分揭示,而以外泌體搭載中藥有效活性成分靶向治療骨質疏松癥可作為未來的研究方向[60],進一步深化中藥單體抗骨質疏松癥的理論研究,助力其臨床運用及新藥研發。