蓽茇調控鐵死亡治療肺癌的作用機制*

李夢珂,常思思,高付彥,盧娟娟,李洪霖

1.河南中醫藥大學,河南 鄭州 450046; 2.河南中醫藥大學第二附屬醫院/河南省中醫院,河南 鄭州 450002

根據2020年全球癌癥統計數據顯示,目前肺癌的發生率排名第2,病死率排名第1[1],我國肺癌的發生率及病死率均排名第1[2]。中醫認為,肺癌病位在肺,本質是機體陽氣運化不足,陰寒積聚,導致體內陰陽失調,故在治療時以扶陽抑陰為原則,可選用溫陽類藥物溫化扶陽、培元固本,以達到陰平陽秘的目的。

蓽茇性辛、熱,屬于溫陽類藥物,其功效為溫中散寒、下氣止痛。有研究證實,蓽茇及其主要活性成分在治療肺癌過程中能發揮重要作用;蓽茇酰胺可抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡,是一種可能的抗肺癌天然產物[3]。蓽茇明堿能夠抑制小鼠瘤塊血管內皮生長因子基因的表達,減慢腫瘤生長的速度[4]。通過進行胡椒堿對人肺癌細胞(A549)和人肺成纖維細胞(W138)的作用實驗,發現胡椒堿能抑制細胞增殖,也能誘導A549凋亡[5]。

鐵死亡是一種程序性細胞死亡,區別于細胞凋亡與壞死,主要是由于鐵依賴性脂質過氧化物出現了損傷從而誘導了細胞的死亡[6]。有研究認為,鐵死亡發生的機制主要與鐵代謝、氨基酸和谷胱甘肽代謝、脂質代謝有關[7]。調控鐵死亡對腫瘤的治療起著很重要的作用,有可能成為治療腫瘤的新方式[8]。有研究表明,蓽茇活性成分能通過調控鐵死亡過程而延緩腫瘤的發生發展[9-10],但機制尚未明確。

網絡藥理學是通過構建網絡模型來分析藥物靶點與疾病基因之間相關性的一種方法[11]。本研究基于網絡藥理學探討蓽茇調控鐵死亡治療肺癌可能的作用機制,為臨床治療肺癌提供依據。

1 材料與方法

1.1 蓽茇有效活性成分獲取及篩選以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(drug like index,DL)≥0.18[12]為篩選條件在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)中檢索收集蓽茇主要活性成分。

1.2 蓽茇有效活性成分作用靶點獲取及篩選運用Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)對1.1所得結果進行靶點基因整理,得到標準化靶點蛋白名稱、蓽茇潛在作用靶點,創建蓽茇活性成分靶點數據庫。

1.3 肺癌靶點收集在Gene Cards數據庫中以“lung cancer”(http://www.genecards.org/)為關鍵詞,搜索與肺癌相關的基因,整理后創建肺癌靶點數據庫。

1.4 蓽茇作用靶點和肺癌作用靶點取交集及蛋白對蓽茇主要活性成分作用的靶點和肺癌作用靶點取交集基因,得到蓽茇治療肺癌的潛在作用靶點。然后輸入String數據庫,獲得蛋白質互作網絡(protein-protein interaction networks,PPI),構建PPI作用網絡。

1.5 基因功能分析和通路富集分析運用R軟件對上述基因進行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析。在程序語言中,定義為P<0.05,Q<0.05,以條形圖形式將分析結果輸出。

1.6 鐵死亡調控基因獲取及其與蓽茇、肺癌三者靶點綜合分析運用FerrDb數據庫[13]和韋恩分析工具獲得鐵死亡調控基因與蓽茇參與調控肺癌的靶基因的公共基因,即上述蓽茇通過調控鐵死亡治療肺癌的靶點。然后使用R軟件對已獲取的三者之間的公共基因組進行KEGG信號通路分析,將分析結果以條形圖形式輸出,并通過String數據庫構建PPI網絡。

1.7 臨床樣本含量分析運用TCGA分析得出的公共基因在臨床表達差異情況。

2 結果

2.1 蓽茇活性成分的篩選在TCMSP中通過篩選得到15個有效活性成分,去除重復靶點后得到158個有效靶點,然后運用Uniprot數據庫轉化基因ID。

2.2 蓽茇作用靶點與肺癌作用靶點的交集在GeneCards中共獲得肺癌相關疾病靶點23 469個,然后將其與藥物有效靶點基因進行比對,得到13個有效活性成分(表1)和68個關鍵靶點,所得即為蓽茇治療肺癌潛在的靶點基因。

表1 蓽茇有效活性成分及對應靶點數

2.3 蓽茇主要有效活性成分、肺癌、靶點相互作用網絡圖通過Cytoscape 3.8.0將蓽茇主要有效活性成分及其作用靶點和肺癌作用靶點進行可視化分析,發現蓽茇通過多成分-多靶點-多通路治療肺癌的作用機制(圖1)。

注:紫色代表藥物蓽茇,紅色代表肺癌,藍色代表藥物有效活性成分,綠色代表共同基因靶點。圖1 蓽茇活性成分-肺癌靶點網絡圖

2.4 PPI的構建及其核心網絡的篩選將得到的68個交集基因輸入String數據庫,選擇限制物種為“Homo Sapiens”,然后取前30個基因進行可視化,繪制PPI網絡及柱狀圖。得到結果包括68個節點,272條邊,平均節點度值8。圖中的節點代表蛋白質,邊代表蛋白質之間的關系(圖2、圖3)。蓽茇與肺癌的PPI結果顯示,IL-10、FOS、ACOX1、IL-6、CREB1等靶點度值相對較高,在肺癌的發生、發展、侵襲、轉移等各種細胞生物活動均有很大的關系[14-18]。

圖2 蓽茇與肺癌的蛋白質相互作用核心網絡圖

圖3 每個基因的度值

2.5 GO功能富集分析對68個蓽茇治療肺癌的關鍵靶點進行GO功能富集分析,共得到104個富集結果。根據校正后P值大小對關鍵靶基因進行排序,展示前20位GO功能富集分析結果(表2、圖4)。結果顯示,蓽茇主要參與G蛋白耦聯胺受體活性、G蛋白耦聯神經遞質受體活性、神經遞質受體活性、突觸后神經遞質受體活性、G蛋白耦聯血清素受體活性、乙酰膽堿受體活性、烯酰輔酶A水合酶活性、兒茶酚胺結合、黃素腺嘌呤二核苷酸結合等。

圖4 關鍵靶點的GO功能富集分析

表2 GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析對蓽茇治療肺癌的68個關鍵靶點進行KEGG通路富集分析,結果顯示共富集在68條通路上,根據校正后P值進行排序,展示前20位KEGG通路富集分析(表3、圖5)。蓽茇治療肺癌的信號通路主要包括TNF信號通路、神經活性配體-受體相互作用、c GMP-PKG信號通路、膽堿能突觸通路、脂質和動脈粥樣硬化通路、化學致癌-受體激活、IL-17、AGE-REGE信號通路、鈣信號通道、心肌細胞的腎上腺素能信號等信號通路。

圖5 關鍵靶點的KEGG通路富集分析

表3 KEGG 通路富集分析

2.7 鐵死亡調控因子的獲取及其與蓽茇、肺癌三者共同基因篩選和分析在FerrDb中獲得259個與鐵死亡相關的基因,將其與68個蓽茇和肺癌的公共基因進行韋恩分析(圖6),獲得5個基因,分別為IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD。這5個基因既是蓽茇的作用靶點也是肺癌治療靶點,同時也是鐵死亡過程調控基因,對其進行KEGG通路分析,篩選條件為P<0.05,共得到阿爾茨海默病、神經退行性疾病-多種疾病通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、C型凝集素受體信號通路、TNF信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、脂質和動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染9條信號通路(圖7)。

圖6 蓽茇調控鐵死亡治療肺癌的靶點

圖7 蓽茇調控鐵死亡治療肺癌的信號通路

對上述5個基因繪制PPI網絡圖(圖8),結果顯示,這5個基因之間相互聯系。另外,通過對比發現蓽茇調控鐵死亡途徑的靶點與蓽茇治療肺癌的核心靶點有重合,推測蓽茇可以通過調控鐵死亡途徑發揮治療肺癌的重要作用。

圖8 蓽茇調控鐵死亡治療肺癌靶點間的PPI網絡圖

2.8 TCGA數據庫分析結果IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD 5個基因在臨床標本數據庫中正常組織與腫瘤組織中的表達存在顯著差異(P<0.05)(圖9)。其中,NOX1、G6PD在腫瘤組織中相對高表達,IL-6、PTGS2在腫瘤組織中的表達量則低于正常組織,差異具有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

本研究利用網絡藥理學分析藥物-靶點-疾病的相互作用關系[19],構建網絡關聯,初步得出蓽茇的主要活性成分、肺癌靶點、關鍵功能靶點,和蓽茇通過調控鐵死亡過程防治肺癌的相關通路。通過分析共得到IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD 5個公共靶點,說明蓽茇通過這5個基因調控鐵死亡起到治療肺癌的作用。

本研究通過對蓽茇有效活性成分的挖掘,發現蓽茇的有效活性成分中主要包括生物堿及酰胺類等,其中胡椒堿、芝麻素、蓽茇酰胺3者是網絡系統中較為核心的成分,提示這3種有效活性成分對肺癌有治療作用。研究顯示,胡椒堿具有很強的抗腫瘤特性,其作用機制主要為抑制轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)抑制誘導的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程,未來胡椒堿將進一步運用于轉移性肺癌和EMT等治療中[20]。芝麻素通過降低肺癌細胞內線粒體離子肽酶1 (lon peptidase 1,mitochondrial,LONP1)水平,達到抑制細胞增殖和生長的目的,LONP1蛋白的減少可能會抑制肺癌的發生、發展[21]。蓽茇酰胺可以促使細胞發生凋亡,抑制肺癌細胞的生長,同時也能抑制細胞集落和細胞遷移的過程[3,22]。

鐵死亡是一種程序性細胞死亡,鐵死亡具有促進和抑制腫瘤的雙重作用[23]。本研究對鐵死亡調控基因進行篩選并與蓽茇和肺癌一起分析,得到 IL-6、NOX1、NOX3、PTGS2和G6PD 5個靶點。IL-6 在肺癌干細胞中能夠促進細胞轉移和增殖,在腫瘤的發生進展等過程中起著重要作用[24]。Han等[25]發現,IL-6可以降低支氣管上皮BEAS-2B細胞活性,促進脂質過氧化,破壞BEAS-2B細胞的鐵穩態并加快誘導鐵死亡。有研究表明,NOX1(胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1)可能通過增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表達,引起A549細胞的凋亡,顯著抑制肺癌細胞增殖的作用[26]。NOX1通過催化產生活性氧過程,阻止誘導ROS來抑制鐵死亡過程[27]。NOX3(酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶3)屬于NOX家族,NOX家族參與一種膜結合酶復合物,與其他蛋白質一起,可以通過質膜運輸電子,產生超氧化物和其他下游ROS,由NOX家族介導的ROS生成可促進鐵死亡的脂質過氧化[28]。李宏謙等[29]提出,NOX3可能通過增加細胞的遷移速率,達到侵襲腫瘤細胞的目的。有研究表明,PTGS2(前列腺素內過氧化物合酶2或環氧合酶2)參與鐵死亡過程當中的脂質代謝,可調節細胞鐵死亡過程,可能促進鐵死亡[30-31]。Pan等[32]發現,環氧合酶抑制劑可以降低ELMO 3(吞噬和運動蛋白3)的表達,而ELMO 3抑制肺癌的生長和轉移有關系。Talmadge等[33]發現,環氧合酶可以促進Lewis肺癌細胞的表達,環氧合酶抑制因子能夠促進特異性 T 細胞反應,在免疫治療學廣泛應用。研究證明,G6PD在多種惡性腫瘤中均有表達,特別是與肺癌的臨床研究相關,是肺癌預后的獨立預測標志物[34]。有研究表明,G6PD可調節核糖-5-磷酸和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的生成,通過調節細胞內NADPH水平,調控鐵死亡過程[35]。綜上,5種核心基因都可以有效地參與鐵死亡進程,同時與肺癌臨床進程相關,所以靶向這些基因進行鐵死亡治療對于肺癌的治療有著至關重要的作用。

目前,臨床治療肺癌多采用多方法綜合治療方案,中醫藥療法作為其中一種治療方案也越來越被認可。以中醫理論方法為指導的溫陽法治療肺癌療效顯著。本文基于網絡藥理學分析蓽茇治療肺癌的網絡關系,通過挖掘蓽茇調控鐵死亡治療肺癌發揮作用的潛在靶標及相關通路,結果顯示,蓽茇治療肺癌與鐵死亡調控有相同基因,說明蓽茇可以通過調控鐵死亡途徑發揮治療肺癌的作用,為中醫藥治療肺癌提供了新思路。