蟲草素對大鼠腎缺血再灌注損傷鐵死亡的影響*

羅進輝,童運濤,張慧,范倩倩,呂彬

1.武漢科技大學附屬漢口醫院,湖北 武漢 430012; 2.華潤武鋼總醫院,湖北 武漢 430080

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是臨床常見的急性損傷性疾病之一,腎移植、腎結石切除術、部分腎臟切除術等外科手術中腎臟血流量被阻斷均可引起RIRI[1],該病致死率較高,且增加了患慢性腎病和終末期腎病的風險,影響全球30%～80%的腎移植患者[2]。氧化應激反應、細胞因子釋放、活性氧生成和毒物積累均是導致RIRI發病的危險因素,而這些病理生理反應均會引起腎小管上皮細胞損傷,導致細胞死亡[3]。最新的研究表明,鐵死亡等細胞程序性死亡參與RIRI的發生發展過程[4]。與常見的細胞凋亡、細胞自噬等過程不同,鐵死亡作為鐵離子依賴的細胞氧化性死亡方式,主要發生在線粒體中,影響細胞內脂質氧化代謝功能[5]。蟲草素是從傳統中藥野生蛹蟲草中提取的天然活性物質,《新華本草綱要》記載:“蛹草性平,味甘,有補精髓,益肺腎,止咳化痰之功效。”蟲草素作為蟲草屬真菌的主要成分,現代藥理研究發現其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、神經保護和腎臟保護等生物活性,在多種炎癥性疾病和氧化應激損傷疾病中發揮重要調節作用[6-7]。然而,目前尚不清楚蟲草素在RIRI鐵死亡中的作用和相關機制。基于此,本次研究采用蟲草素處理RIRI模型大鼠觀察其對大鼠腎臟組織損傷及鐵死亡的影響,探討其可能存在的機制,旨在為蟲草素應用于RIRI疾病的臨床治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物24只雄性SD大鼠購自湖北省實驗動物研究中心,均為6～8周齡,體質量為180～220 g,飼養于空氣濕度為50%,相對溫度為23 ℃條件下,給予充足的飲用水和食物,適應性喂養1周后。本研究經武漢市漢口醫院倫理委員會審批通過,倫理編號:hy11202114。

1.2 藥物與試劑蟲草素(上海懋康生物科技有限公司,貨號:MS0075);鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1(美國selleck生物科技有限公司,貨號:S7243);鐵離子比色法檢測試劑盒(Abcam公司,貨號:ab83366);二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(dichlorodihydrofluorescein acetoacetate,DCFH-DA)培養液(西安百螢生物科技有限公司,貨號:15204);谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、溶質載體家族7成員11(recombinant solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain 1,FTH1)、長鏈脂酰輔酶A合成酶4(long chain acyl CoA synthase 4,ACSL4)、核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1,NOX1)、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX2)一抗(山羊抗小鼠IgG抗體,美國Thermo Fisher Scientific公司,貨號:MA5-32827、711589、701934、PA5-27137、PA5-27882、PA5-88606、MA5-14568)及相應二抗(Abcam公司,山羊抗小鼠IgG抗體,美國Thermo Fisher Scientific公司,貨號:MA5-32827、711589、701934、PA5-27137、PA5-27882、PA5-88606、MA5-14568);ECL顯色發光劑(福州奧研實驗器材有限責任公司,CAS號:BL523B)。

1.3 儀器顯微鏡(北京瑞科中儀科技有限公司,型號:Olympus CX33);全自動生化儀(武漢宏康世紀科技發展有限公司,型號:XR220);流式細胞儀(上海三崴醫療設備有限公司,型號:FACSVia);微孔板閱讀器[賽默飛世爾科技(中國)有限公司,型號:Varioskan LUX]。

2 方法

2.1 RIRI大鼠分組及模型構建將24只大鼠隨機分為對照組、模型組、蟲草素組和鐵死亡抑制劑組,每組各6只,除對照組外,其余3組大鼠均構建RIRI模型。造模開始前,蟲草素組大鼠腹腔注射 8 mg·kg-1蟲草素,鐵死亡抑制劑組大鼠腹腔注射5 mg·kg-1Ferrostatin-1,對照組和模型組給予等劑量生理鹽水腹腔注射,連續注射7 d[8]。7 d后采用45 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射將大鼠麻醉,待麻醉生效后,去除大鼠背部皮毛并消毒,沿背部脊椎和肋骨下緣1 cm處剪開皮膚、肌肉,暴露腎臟,分離腎動脈,使用動脈夾夾閉兩側腎動脈,缺血處理 1 h 后松開動脈夾,恢復血流,當觀察到腎臟動脈充盈,顏色由暗紅變為鮮紅時,表明RIRI模型構建成功[9]。對照組大鼠僅切開暴露腎動脈,不使用動脈夾夾閉。所有大鼠均在確定無臟器損傷及出血后將腸管放至原位,使用5-0細線逐層縫合關腹,體積分數75%酒精常規消毒后保持常規飼養。各組大鼠均未出現死亡,最終納入統計的每組大鼠均為6只。

2.2 腎臟病理損傷觀察術后24 h,取大鼠腎組織,切成5 mm3小塊,脫水透明封片后制成石蠟切片,采用過碘酸雪夫氏染色(periodic acid-schiff stain,PAS)觀察腎臟病理損傷情況。將石蠟切片用梯度酒精脫水后以0.5%過碘酸水溶液氧化 30 min,自來水沖洗15 min后加入schiff試劑浸染15 min,沖洗15 min后蘇木精染液復染5 min,沖洗15 min后加入鹽酸酒精處理1～3 s,自來水沖洗 10 min 后梯度酒精和二甲苯溶液脫水,明膠樹脂封片,顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織病理染色情況。

2.3 腎臟指標檢測手術24 h后,采集各組大鼠頸總動脈血,采用全自動生化儀檢測各組大鼠頸總動脈血中血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(serum creatinine,Scr)含量。

2.4 Fe2+、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和線粒體超氧化物水平檢測將各組大鼠腎組織以PBS緩沖液沖洗,加9倍量勻漿介質研磨,4 000 r·min-1離心10 min(離心半徑10 cm),取上清液,采用鐵離子比色法測定腎組織中Fe2+含量。將組織勻漿上清液加入96孔板中,每孔加入裂解液 200 μL,搖床裂解2 h;將3 mmol·L-1標準品稀釋為300 μmol·L-1、150 μmol·L-1、75 μmol·L-1、37.5 μmol·L-1、18.75 μmol·L-1、9.38 μmol·L-1、4.69 μmol·L-1,設定對照孔。將4.5%高錳酸鉀溶液與PBS按11混合配置為混合液,混合均勻后,60 ℃孵育60 min,冷卻室溫,加鐵離子檢測劑 30 μL,混勻,室溫孵育0.5 h,取200 μL加入96孔板培養,多功能酶標儀檢測吸光度(550 nm波長處),繪制標準曲線,獲得Fe2+含量。將腎組織置于預冷的50 mL離心管中,PBS沖洗3次后與ROS檢測試劑盒中25 μmol·L-1DCFH-DA培養液在37 ℃條件下避光培養30 min,30 min后PBS再次沖洗3次,常規消化后以 1 800 r·mim-1的轉速離心5 min,丟棄上清液,剩余部分于1 mL PBS緩沖液中懸浮,采用流式細胞儀檢測各組大鼠腎組織中的ROS水平,并于顯微鏡下觀察染色情況。此外,取各組大鼠腎組織,按照先前的方法分離出腎小管上皮細胞[10],使用Mitosox熒光探針檢測線粒體超氧化物水平,將細胞在Mitosox Red的hank緩沖液中培養30 min,PBS緩沖液清洗細胞,于波長 488 nm 和525 nm下檢測Mitosox熒光強度,并根據染色及未染色的細胞于吸收波長為488 nm下進行Mitosox紅光閾值調整。

2.5 細胞凋亡檢測取各組大鼠腎組織,采用 Percoll 密度梯度離心法[11]分離培養腎小管上皮細胞,再采用Annexin V/7-amino-actinomycin D染色法[12]檢測細胞凋亡水平。將5×105個大鼠腎上皮細胞重懸于100 μL PBS緩沖液中,37 ℃避光條件下加入2.5 μL PE-Annexin V和2.5 μL 7-AAD,共同孵育15 min,再加入400 μL緩沖液,采用一次性管輕輕吹勻細胞后以流式細胞儀檢測各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡率,設置FL1通道檢測Annexin V綠色熒光,FL3通道檢測AAD紅色熒光。

2.6 Western Blot檢測相關蛋白表達水平采用Western Blot法檢測各組大鼠腎組織中GPX4、SLC7A11、FTH1、ACSL4、Nrf2、NOX1和COX2的蛋白表達水平,每組取3只,實驗重復3次。使用 RIPA 裂解液提取總蛋白,BCA法對蛋白質濃度進行定量檢測,12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉移至膜,室溫下采用5%脫脂奶粉封閉 2 h,4 ℃下與GPX4、SLC7A11、FTH1、ACSL4、Nrf2、NOX1、COX2一抗(稀釋比例均為11 000)避光孵育過夜,Tris磷酸鹽緩沖液清洗后用辣根過氧化物酶標記的熒光二抗(稀釋比例均為1500)37 ℃ 下孵育1 h。Tris磷酸鹽緩沖液清洗3次后,避光條件下采用ECL顯色發光劑進行顯影,以GAPDH作為內參計算各組蛋白灰度值。

3 結果

3.1 各組大鼠腎臟病理損傷對比PAS染色結果顯示,對照組大鼠腎小囊、腎小球和腎小管結構清晰,腎小管上皮細胞排列整齊,基底膜完整;模型組大鼠腎小囊囊腔、腎小管管腔擴張明顯,腎小球萎縮,間隙增加,伴有間質水腫等明顯損傷特征,腎小管基底膜不規則增厚;蟲草素組和鐵死亡抑制劑組相較于模型組腎小囊囊腔、腎小管管腔擴張程度明顯減輕,腎小球體積相對正常,間隙增加和間質水腫明顯改善,基底膜完整度更好,PAS陽性染色明顯減少。與對照組比較,模型組大鼠腎組織PAS陽性面積比例明顯升高(P<0.01);與模型組比較,蟲草素組和鐵死亡抑制劑組PAS陽性染色面積比例明顯降低(P<0.01),見圖1。

3.2 各組大鼠BUN、Scr含量對比與對照組比較,模型組BUN和Scr含量顯著升高(P<0.01),而與模型組比較,蟲草素組和鐵死亡抑制劑組BUN和Scr含量顯著降低(P<0.01),見圖2。

3.3 各組Fe2+、ROS 和線粒體超氧化物水平對比與對照組比較,模型組Fe2+、ROS和線粒體超氧化物水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,蟲草素組和鐵死亡抑制劑組Fe2+、ROS和線粒體超氧化物水平顯著降低(P<0.05),見圖3。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖3 各組Fe2+、ROS 和線粒體超氧化物水平對比

3.4 各組細胞凋亡水平對比與對照組比較,模型組細胞凋亡率顯著升高(P<0.01);而與模型組比較,蟲草素組和鐵死亡抑制劑組細胞凋亡率顯著下降(P<0.01),見圖4。

注:與對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01。圖4 各組細胞凋亡水平對比

3.5 各組鐵死亡相關蛋白表達水平對比與對照組比較,模型組GPX4、SLC7A11、FTH1和Keap1的蛋白表達水平顯著下調(P<0.05),ACSL4、Nrf2、NOX1和COX2的蛋白表達水平顯著上調(P<0.05);而與模型組比較,蟲草素組和鐵死亡抑制劑組GPX4、SLC7A11、FTH1和 Keap1蛋白表達水平顯著上調(P<0.05),ACSL4、Nrf2、NOX1和COX2的蛋白表達水平顯著下調(P<0.05),見圖5。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖5 各組鐵死亡相關蛋白表達水平對比

4 討論

腎臟作為人體生成尿液、清除代謝產物、吸收有用物質的關鍵器官之一,對于維持機體酸堿平衡、電解質平衡和內分泌穩定具有重要意義,當腎功能受損時,不但影響腎臟自身功能,還會影響心臟、大腦等其他器官的穩定。RIRI是腎移植、腎切除、大出血等外科手術中常見并發癥,也是慢性腎衰竭和終末期腎病的主要誘因之一[13]。隨著對RIRI的不斷探索,研究發現,機體炎癥反應、氧化應激反應等多種生理病理在RIRI發病時被激活,參與介導RIRI的疾病進展[14]。鐵死亡作為一種調節性細胞死亡過程,在多種癌癥疾病、中樞神經系統疾病、心腦血管疾病以及缺血再灌注損傷疾病中發揮重要作用[15]。研究表明,鐵死亡通過調控鐵積累、脂質氧化及相關基因表達在RIRI的發生發展過程中發揮關鍵作用[16]。

本次研究通過構建RIRI大鼠模型,探究中藥提取物蟲草素對RIRI大鼠鐵死亡的影響。RIRI模型是目前公認的較為穩定、適用于分析藥物作用的動物模型之一[17],本次研究通過暴露大鼠腎動脈,采用動脈夾誘導缺血1 h后恢復供血的方式構建RIRI模型,PAS染色觀察各組大鼠腎組織病理損傷情況,結果顯示模型組大鼠腎小囊囊腔、腎小管管腔擴張明顯,腎小球萎縮,間隙增加,伴有間質水腫等明顯損傷特征,且PAS陽性染色明顯增多,表明模型大鼠腎臟病理改變明顯,這也與譚微等[18]研究結論相符。Ferrostatin-1作為常用的鐵死亡抑制劑,在本次研究中作為天然活性物質蟲草素的對照組,二者分別處理RIRI模型大鼠,結果顯示,鐵死亡抑制劑和蟲草素均可顯著改善RIRI大鼠腎臟病理損傷水平,顯著改善腎功能指標BUN和Scr水平,對模型大鼠的腎功能有較好的保護作用。蟲草素是有著“黃金草”之稱的冬蟲夏草的主要活性成分,是第一個從真菌中分離出的核苷類抗生素,具有較好的安神和補腎功效[19]。蟲草素的獨特之處在于其即可補肺陰,又可補腎陽,對于調節陰陽平衡具有極高的價值。現代藥理學研究提示,蟲草素在保健、抗衰老、神經保護、肺腎保護、抗腫瘤、抗炎、抗氧化和免疫調節方面同樣表現優異[20]。本次研究中蟲草素對RIRI大鼠腎功能的保護作用就在于其優秀的抗炎、抗氧化生物特性,通過灌胃蟲草素減輕因缺血再灌注介導的氧自由基產生,抑制氧化應激反應[21],使其免受缺血再灌注導致的腎臟損傷,保護腎功能[22]。

本次研究結果發現,蟲草素可顯著抑制模型大鼠腎臟組織內Fe2+、ROS和線粒體超氧化物水平,抑制腎上皮細胞凋亡,上調鐵死亡相關蛋白GPX4、SLC7A11、FTH1和Keap1的表達水平,下調ACSL4、Nrf2、NOX1和COX2的表達水平,表明蟲草素通過調控鐵死亡相關蛋白的表達水平,減少腎臟內鐵積累,抑制氧化應激反應、線粒體凋亡和鐵死亡過程,從而在腎臟保護中發揮重要作用,這也與Aydin等[23]研究結果基本一致。過氧化氫、單線態氧、超氧陰離子自由基和羥自由基是ROS的主要形式,ACSL4可催化長鏈脂肪酸和輔酶A形成脂酰輔酶A,抑制ACSL4可抑制硒蛋白GPX的表達,下調SLC7A11、FTH1和Keap1等的表達,特異性清除磷脂過氧化氫從而抑制鐵死亡[24]。鐵死亡作為鐵離子依賴的細胞氧化性死亡方式,下調GPX4、SLC7A11、FTH1和Keap1等的表達可使細胞內的脂質氧化物無法通過這些分子進行谷胱甘肽還原反應[25],導致ROS的大量沉積,線粒體細胞膜斷裂,超氧化物水平增多,氧化還原失衡,細胞發生程序性死亡[26]。蟲草素作為冬蟲夏草和蛹蟲草等中草藥蟲草屬真菌的主要活性成分之一,具有降血脂、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化應激、清除自由基、抑制微生物生長和調節免疫等藥理作用,在多種炎癥性疾病和惡性腫瘤疾病中發揮關鍵效應[27-28]。最新研究發現,蟲草素可通過改善腎缺血再灌注大鼠氧化應激狀態,抑制腎上皮細胞增殖和分化,改善腎小球濾過率[29]。在本次研究中,蟲草素可上調GPX4、SLC7A11等蛋白表達水平,下調ACSL4、Nrf2等蛋白表達水平,抑制Fe2+積累,使線粒體膜電位發生改變,影響線粒體膜通透性和電位去極化[30],抑制細胞內活性氧的積累,加速脂質代謝,維持氧化還原反應平衡,抑制鐵死亡過程的發生,減少腎臟細胞凋亡水平,發揮保護模型大鼠腎功能的作用[31]。

綜上所述,蟲草素可調節鐵死亡相關蛋白的表達,抑制氧化應激反應、活性氧生成、Fe2+積累,降低鐵死亡和細胞凋亡,從而有效保護腎缺血再灌注損傷大鼠腎功能,本研究為蟲草素應用于腎缺血再灌注損傷的治療提供了更多數據支持,值得臨床參考借鑒。