circ_0008039調控乳腺癌細胞自噬、增殖及細胞周期機制研究

李 今,雷 瑩,郭靜姝,高建華

1.西北婦女兒童醫院乳腺甲狀腺外科,陜西西安 710061;2.榆林市第一醫院普通外科二病區,陜西榆林 719000

乳腺癌的發病機制尚未完全明確,有研究發現乳腺癌中環狀核糖核酸(circRNA)的表達失調可導致調控細胞發生增殖、遷移、侵襲等生物學行為,故circRNA可作為診斷乳腺癌的生物標志物[1-2]。有研究發現circ_001783通過充當微小RNA(miR)-200c-3p的海綿分子而參與乳腺癌的進展過程[3]。circ_0052112通過充當miR-125a-5p的海綿分子促進乳腺癌細胞遷移和侵襲[4]。circ_0008039在乳腺癌細胞中的表達水平升高,具有提高增殖、遷移能力的作用,與靶向miR-432-5p/E2F轉錄因子3(E2F3)軸相關[5]。miR-1287-5p在宮頸癌中呈低表達,circSLC26A4通過調節miR-1287-5p/同源盒蛋白Hox-A7(HOXA7)軸促進宮頸癌的進展[6]。靶基因預測顯示circ_0008039與miR-1287-5p存在結合位點。目前在circ_0008039是否通過調節miR-1287-5p影響乳腺癌進展過程方面尚無相關研究。本研究旨在探討circ_0008039對乳腺癌細胞自噬、增殖、細胞周期的影響及其機制。現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年10月西北婦女兒童醫院診治的30例乳腺癌患者作為研究對象,年齡50～67歲,平均(60.03±4.68)歲,收集所有研究對象的乳腺癌組織和癌旁組織用于后續檢測。納入標準:(1)經癥狀體征、臨床表現、影像學檢查、術前或術后病理組織學檢查確診為乳腺癌;(2)首次確診及治療,既往無乳腺病史(包括乳腺癌、乳腺纖維瘤、乳腺炎等乳腺疾病);(3)未采取手術、化療、放療及內分泌等治療手段;(4)卡氏功能狀態(KPS)評分≥70分,預計生存期≥6個月。排除標準:(1)合并其他腫瘤、嚴重心血管病等疾病;(2)存在其他腫瘤乳腺轉移。所有患者均知情同意且簽署知情同意書。本研究經西北婦女兒童醫院醫學倫理委員會批準(YLL035)。

1.2方法

1.2.1實驗分組 將健康人乳腺上皮細胞(MCF-10A)、乳腺癌細胞系(SKBR3、BT474、MCF-7、BT-20)細胞置于DMEM培養液中培養,待融合度達70%時開始傳代。調整數期BT-20細胞的密度為1×105/mL,并將其接種于96孔板,每孔100 μL,分別將si-NC、si-circ_0008039(敲低circ_0008039)、si-circ_0008039與anti-miR-NC、si-circ_0008039與anti-miR-1287-5p(下調miR-1287-5p)轉染至BT-20細胞,分別記為si-NC組、si-circ_0008039組、si-circ_0008039+anti-miR-NC組及si-circ_0008039+anti-miR-1287-5p組。

1.2.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定circ_0008039、miR-1287-5p表達水平 提取癌旁組織、乳腺癌組織中MCF-10A、SKBR3、BT474、MCF-7、BT-20細胞及轉染后的BT-20細胞中的總RNA,測定水平后,采用反轉錄試劑獲得cDNA,并以此為模板進行qRT-PCR,應用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測circ_0008039、miR-1287-5p表達水平。

1.2.3CCK-8法檢測BT-20細胞增殖 BT-20細胞經1.2.1處理后,用10 μL CCK-8溶液孵育細胞2 h,然后在450 nm處測量吸光度(A)。

1.2.4細胞周期檢測 各組細胞加入預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、離心、重懸(500 μL),加入3.5 mL 預冷70%乙醇溶液,置于4 ℃環境中孵育24 h,以3 000 r/min離心5 min,去上清液,加入50 μL核糖核酸酶A(RNaseA),置于37 ℃環境中孵育30 min,加入450 μL碘化丙啶(PI)染色液,置于4 ℃環境中孵育30 min,采用上流式細胞儀測定細胞周期[包括細胞停止分裂(G0)期/DNA合成前(G1)期、DNA合成(S)期、DNA合成后(G2)期/細胞分裂(M)期]。

1.2.5雙熒光素酶報告基因驗證circ_0008039與miR-1287-5p的靶向關系 采用Circinteractome數據庫預測顯示circ_0008039與miR-1287-5的結合位點。BT-20細胞與構建成功的野生型/突變型載體WT/MUT-circ_0008039與miR-NC或miR-1287-5p mimics共轉染。轉染24 h后,檢測熒光素酶活性。

1.2.6蛋白質印跡法(Western blotting)檢測微管相關蛋白輕鏈3B(LC3B)、Beclin-1、p21、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)蛋白的表達水平 用400 μL RIPA裂解液提取總蛋白,定量后用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠分離蛋白,然后轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在5%脫脂奶粉中封閉2 h,加入LC3B、Beclin-1、p21、CyclinD1一抗(1∶1 000),置于4 ℃環境中過夜;與二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h,采用增強型化學發光試劑(ECL)顯影,計算LC3B、Beclin-1、p21、CyclinD1蛋白的表達水平。

1.3細胞與試劑 MCF-10A、SKBR3、BT474、MCF-7、BT-20細胞購自美國ATCC細胞庫;Lipofectamine2000購自北京索萊寶;si-NC、miR-NC、anti-miR-NC、si-circ_0008039、miR-1287-5p mimics、anti-miR-1287-5p購自上海吉瑪;反轉錄試劑、熒光定量PCR試劑購自日本TaKaRa公司;Trizol試劑購自上海杰美基因醫藥科技有限公司;CCK-8試劑購自MCE公司;兔抗人LC3B、Beclin-1抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;兔抗人p21、CyclinD1抗體、山羊抗兔IgG(HRP標記)二抗購自美國Abcam公司。

2 結 果

2.1人乳腺癌組織和癌旁組織細胞中circ_0008039和miR-1287-5p的表達水平比較 乳腺癌組織的circ_0008039表達水平高于癌旁組織,miR-1287-5p表達水平低于癌旁組織,差異均有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 circ_0008039和miR-1287-5p在人乳腺癌組織和癌旁組織中的表達水平比較

2.25種乳腺細胞中circ_0008039的表達水平比較 乳腺癌SKBR3、BT474、MCF-7、BT-20細胞中circ_0008039的表達水平高于MCF-10A細胞,差異均有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 circ_0008039在人乳腺癌細胞中的表達水平

2.3敲低circ_0008039后si-NC組和circ_0008039組的BT-20細胞A及相關蛋白水平比較 si-circ_0008039組A、CyclinD1蛋白表達水平低于si-NC組,LC3B、Beclin-1、p21蛋白表達水平高于si-NC組,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖1、表3。

圖1 si-NC組和si-circ_0008039組自噬、增殖相關蛋白表達水平

表3 敲低circ_0008039后si-NC組和circ_0008039組的BT-20細胞A及相關蛋白水平比較

2.4敲低circ_0008039后si-NC組和circ_0008039組的BT-20細胞周期比例比較 si-circ_0008039組G0/G1期細胞比值大于si-NC組(P<0.05),兩組S期細胞比例和G2/M期細胞比值比較,差異均無統計學意義(P>0.05),見表4。

表4 敲低circ_0008039后 si-NC組和circ_0008039組的BT-20細胞周期比例比較

2.5miR-NC組和miR-1287-5p組雙熒光素酶活性比較 circ_0008039與miR-1287-5p存在互補的核苷酸位點,見圖2。miR-1287-5p組WT-circ_0008039載體的熒光素酶活性低于miR-NC組(P<0.05), miR-NC組和miR-1287-5p組MUT-circ_0008039載體的熒光素酶活性比較,差異無統計學意義(P>0.05),見表5。

圖2 circ_0008039與miR-1287-5p的結合位點

表5 miR-NC組和miR-1287-5p組雙熒光素酶活性比較

2.6下調miR-1287-5p表達水平后si-circ_0008039+anti-miR-NC組及si-circ_0008039+anti-miR-1287-5p組miR-1287-5p水平、A、BT-20細胞周期比例、相關蛋白水平比較 si-circ_0008039+anti-miR-1287-5p組的miR-1287-5p水平、G0/G1期細胞比值、LC3B、Beclin-1、p21蛋白水平低于si-circ_0008039+anti-miR-NC組,si-circ_0008039+anti-miR-1287-5p組的A、S期細胞比例、CyclinD1蛋白水平高于si-circ_0008039+anti-miR-NC組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表6。

圖3 自噬、增殖相關蛋白表達水平

表6 下調miR-1287-5p表達水平si-circ_0008039+anti-miR-NC組及si-circ_0008039+anti-miR-1287-5p組miR-1287-5p水平、A、BT-20細胞周期比例、相關蛋白水平比較

3 討 論

circRNA在乳腺癌中的表達水平異常,同時可充當微小核糖核酸(miRNA)的海綿分子參與乳腺癌發病機制,circRNA_0006528作為競爭性內源RNA通過充當miR-7-5p的海綿分子并激活MAPK /ERK信號通路而促進乳腺癌的發展[7]。circRNA_0025202通過調節miR-182-5p /FOXO3a軸而調節乳腺癌的進展[8]。circEPSTI1可能作為判斷乳腺癌患者預后的標志物[9]。目前circRNA對乳腺癌進展的影響及作用機制尚未完全明確。circ_0008039通過充當miR-515-5p的海綿分子而上調多梳蛋白4從而促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[10]。circ_0008039在膀胱癌組織中顯著上調,其可能促進膀胱癌進展[11]。本研究結果顯示,circ_0008039在人乳腺癌組織中表達水平升高,提示circ_0008039可能促進乳腺癌進展。進一步研究發現,敲低circ_0008039可抑制乳腺癌細胞活力,下調S期細胞比例,提高G0/G1期細胞比值,并可降低CyclinD1蛋白水平及提高p21蛋白水平。CyclinD1與p21蛋白在腫瘤中表達異常,并可通過調控細胞周期從而調節細胞增殖[12]。上述結果表明敲低circ_0008039對乳腺癌細胞增殖的抑制作用與阻滯細胞周期相關。細胞自噬水平升高可促進細胞凋亡,其中LC3B、Beclin-1蛋白水平升高預示自噬水平升高[13]。本研究結果顯示,敲低circ_0008039可提高LC3B、Beclin-1蛋白的表達水平,提示敲低circ_0008039可促進乳腺癌細胞自噬。

本研究證實circ_0008039可充當miR-1287-5p的海綿分子,進一步研究發現miR-1287-5p在乳腺癌組織中表達水平降低,提示miR-1287-5p可能起抗乳腺癌的功能。miR-1287-5p通過與磷酸肌醇3激酶CB相互作用抑制乳腺癌的生長[14]。LncRNA PRKCQ-AS1通過調節miR-1287-5p/YBX1軸促進結直腸癌細胞增殖和遷移[15]。上調circ-UBE2D2可充當miR-1236/miR-1287的海綿分子,促進乳腺癌細胞轉移和增殖[16]。本研究發現,下調miR-1287-5p表達水平可能提高乳腺癌細胞增殖能力,并降低自噬。本研究還發現,同時下調circ_0008039、miR-1287-5p表達可顯著提高乳腺癌細胞活力,降低LC3B、Beclin-1蛋白的表達水平及G0/G1期細胞比值,并可提高S期細胞比例,提示抑制miR-1287-5p表達可明顯逆轉敲低circ_0008039對乳腺癌細胞自噬、增殖及細胞周期的作用。

綜上所述,敲低circ_0008039可阻滯細胞周期、促進細胞自噬并抑制細胞增殖,其機制與上調miR-1287-5p表達有關,circ_0008039可能是乳腺癌治療的潛在生物標志物,為研究circ_0008039在其他癌癥中的作用提供了參考,也為乳腺癌的靶向分子治療提供了新的理論基礎。