AlkB蛋白介導的核酸去甲基化在植物中的研究進展

●周 穎

（重慶大學生物工程學院 重慶 404100）

AlkB蛋白介導的核酸去甲基化屬于表觀遺傳領域，是當今醫學上的一個熱門研究方向，已在癌癥早篩、伴隨診斷、藥物研發上有所應用，如m6A去甲基化酶FTO可運用在抑制白血病細胞增殖上，有望成為白血病新的分子治療靶點和臨床預后指標[1]；ALKBH5抑制物可用于治療病毒感染性疾病或與病毒感染相關的疾病[2]。但是到目前為止，關于其家族去甲基化的研究主要集中在人和哺乳動物，對植物的研究則相對較少，通過綜述該家族蛋白在植物領域的最新研究進展，以期為其植物領域上的研究提供理論依據。

1 甲基化與去甲基化

甲基化是核酸化學修飾中最多的一種，它不改變基因的序列，卻對基因表達、細胞命運及個體發育等過程起到關鍵的調控作用。目前，已報道發生在 DNA上的甲基化修飾有3種：5-甲基胞嘧啶（5-mC），是最重要的一種DNA甲基化修飾，廣泛存在于植物、動物等真核生物基因組中，被稱為“第五堿基”；5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），也稱哺乳動物的“第六堿基”；N6-甲基腺嘌呤（N6-mA），最先在小鼠胚胎干細胞DNA修飾中被發現，也存在于細菌、藻類及動植物基因組中。已報道發生在RNA上的甲基化有3種：N6-腺苷酸甲基化（m6A），是RNA上最豐富的一種修飾，存在于大多數真核生物和一些病毒的mRNA中，也存在于tRNA、rRNA、snRNA以及lncRNA中；N1-腺苷酸甲基化（m1A）；胞嘧啶羥基化（m5C）。同時，人們對與甲基化相對應的去甲基化過程越來越感興趣，研究發現了一種蛋白——AlkB，它可以去除DNA、RNA中的甲基和其他烷基，實現核酸化學修飾的可逆性。

2 AlkB蛋白的結構特征

1983年，Kataoka等[3]發現大腸桿菌突變菌株對甲基磺酸甲酯（MMS）十分敏感，并將該潛在功能基因命名為AlkB。隨后分析證實了AlkB是鐵（II）和α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶超家族，它以亞鐵離子為輔因子，α-酮戊二酸為共底物進行各種氧化反應，進而去除DNA、RNA中的甲基和其他烷基，實現核酸化學修飾的可逆性。

大多數AlkB家族成員都包含一個由200～300個氨基酸組成的“Jelly-roll”拓撲結構，即AlkB結構域，其主要由兩個β折疊片組成，也稱雙鏈β-螺旋（DSBH）。在DSBH核心“開放端”的組氨酸-X-天冬氨酸（HXD）基序，以及其下游的第二個組氨酸是這個家族中高度保守的基序。HXD這三個殘基能催化鐵原子的配位，并且α-酮戊二酸輔因子的兩個氧原子也能進一步形成鐵的八面體配位。DSBH上的最后一個β折疊始末有兩個保守的精氨酸殘基，能與2-OG形成鹽橋相互作用，進一步穩定α-酮戊二酸的結合[4]。該家族還存在一個保守的核苷酸識別蓋，由一個小的β折疊組成，有助于識別底物特異性。除了催化、識別上具有保守性質外，AlkB家族的堿基結合成員還有一個特征，就是所結合的殘基都是有芳香堆積在受損堿基上，盡管在不同的家族成員之間沒有嚴格保守的芳香殘基類型。

3 植物的AlkB蛋白

近些年，AlkB家族蛋白的生物學功能、生化活性和結構特征主要集中在哺乳動物與大腸桿菌上進行研究，在植物中的報道很少。目前，在擬南芥中共鑒定出13個AlkB家族基因，即：ALKBH1A、ALKBH1B、ALKBH1C、ALKBH1D、ALKBH2、ALKBH6、ALKBH8A、ALKBH8B、ALKBH9A、ALKBH9B、ALKBH9C、ALKBH10A和ALKBH10B。其中ALKBH9A、ALKBH9B、ALKBH9C、ALKBH10A和ALKBH10B具有與人類 ALKBH5蛋白最相似的氨基酸序列。

擬南芥AtALKBH2蛋白對DNA中的甲基和乙烯加合物表現出體外修復活性，敲除AtALKBH2基因后植株對甲基化誘變劑MMS敏感，種子、葉片形狀不正常，細胞壞死增加，說明AtALKBH2能夠保護擬南芥免受DNA甲基化損傷，與其他AlkB同系物一樣，在擬南芥中行使去甲基化功能[5]。AtALKBH6為潛在的去甲基化酶，具有與m6A和m5C RNA結合的能力，在種子萌發、幼苗生長和非生物脅迫中發揮重要作用[6]。AtALKBH8A與哺乳動物ALKBH8的功能類似，參與成熟tRNA的加工[7]。AtALKBH8B在擬南芥對鹽脅迫和脫落酸（ABA）的反應中起作用。AtALKBH8B過表達的轉基因擬南芥植株表現出耐鹽性，與野生相比，AtALKBH8B過表達轉基因植株的總m6A水平降低。外源施加ABA后，AtALKBH8B突變體植株的子葉綠化和幼苗生長遠高于野生型[8]。AtALKBH9B具有6-meA去甲基化酶活，并與苜蓿花葉病毒的外殼蛋白相互作用，最終影響病毒感染[9]。擬南芥中敲除ALKBH10B，增加了開花激活因子（FT）及其上游基因SPL3和SPL9的m6A修飾，高甲基化的mRNA加速衰變，從而表現出開花延遲，營養生長受到抑制的表型[10]。在含有2μ、4μ的ABA培養基上，AtALKB10B突變體的根長受到明顯的抑制，檢測發現ABI3和ABI4基因表達量上調，說明AtALKB10B還與ABA相關。AtALKBH10B突變體的還表現出耐鹽表型，在鹽脅迫下ATAF1、BGLU22和MYB73的表達量下調[11]。

隨后，其他植物中的AlkB蛋白也陸續被發現。西瓜ClALKBH2B和ClALKBH4B受不同的轉錄因子調控，且ClALKBH4B 基因可抑制黃瓜綠斑駁花葉病毒積累[12]。水稻OsALKBH1對ss DNA的m1d A具有去甲基化的酶活，且其酶活強于m6dA，并通過EMSA等實驗證明OsALKBH1與ss DNA、ds DNA存在互作[13]。番茄中的SLALKBH2可介導6-meA去甲基化酶通過穩定SlDML2mRNA的水平來促進番茄果實成熟[14]。番茄SLALKBH3可以通過影響3'UTR區域中乙烯相關基因的m6A修飾的表達量來調控番茄花柄脫落[15]。番茄中還存在一個與哺乳動物ALKBH2同源的蛋白，序列號為XP_004236651，對該基因敲除，發現突變體植株對DNA甲基化劑MMS高度敏感，具體表現在幼苗的生長延緩、種子發芽率低、離體葉片快速衰老以及畸形率升高，并且敲除該同源基因還會導致具有高轉錄活性的rDNA甲基化程度升高[16]。

4 總結與展望

近年來，隨著新一代測序技術的發展，在分析ALKB家族蛋白以及去甲基化方面取得了很大進展，但是也存在一些疑問。比如擬南芥的AtALKBH10B雖屬ALKB同源物，但并不具有該家族鐵（II）和α-酮戊二酸依賴性雙加氧的典型的結構域，卻也同樣具有去甲基化的功能，那么猜測是否該家族還存在其他發揮作用的位點亦或是其他原因。此外，在植物生長發育的各階段中，ALKB受什么信號調控、何時發生去甲基化、如何維持植物體內甲基化與去甲基化的動態平衡等，還需要未來進一步研究，進而在農業生產上有更好運用。