動物細胞規模化培養技術現狀

1 貼壁培養

貼壁培養是在某一固相表面貼附細胞并對其培養的一種動物細胞規模化培養技術，動物細胞必須貼附于攜帶有部分電荷的固體表面或者半固體表面，只有這樣動物細胞才能生長。目前，大部分動物細胞培養均為這一類型。

1.1 生長特性

在培養貼壁依賴型細胞時，必須保證其緊密附著于培養器皿壁上或培養瓶瓶壁上，細胞原本形狀為圓形，在其貼壁后將會立即鋪展開來，并進行有絲分裂，在很短時間內細胞便會開始對數生長。通常僅需數日細胞就會將培養壁表面鋪滿，同時構建一個密集性較高的細胞單層。需注意的是，貼壁表面必須具備高度表面活性并攜帶有凈陽電荷，同時要求微載體具備一定電荷密度，如果貼壁表面為有機物表面，還需保證其具備明顯的親水性特點，同時攜帶有陽性電荷。

1.2 貼壁培養優點

第一，細胞會在固相表面緊密附著，在培養過程中可將舊培養液直接倒掉，清洗干凈后直接裝入新的培養液，更換培養液較為便利。第二，由于細胞在載體表面固定，此方式無需配備過濾系統，可通過灌注方式以提升細胞密度。第三，在細胞附著于生長基質表面時，細胞對某一產品的表達效果將更加理想。第四，可利用統一設備對多種細胞進行培養，同時可以結合實際需求調整細胞液及細胞間的比例。

1.3 貼壁培養缺點

在細胞貼壁后，其消化難度較大，最終會增加擴大培養的難度。培養過程中培養設施需要較大的占地面積，同時相關設備需要較多的資金。在細胞反應器培養過程中，無法通過顯微鏡觀察細胞，無法實時監測細胞的生長狀態。在控制細胞環境的過程中，很難實現完全的均勻化。

1.4 貼壁培養系統

1.4.1 轉瓶培養系統

在貼壁依賴型細胞培養過程中，轉瓶培養系統是最早采用的一種系統。在小型培養過渡至大規模培養時，一般采用轉瓶培養。在轉瓶（旋轉的圓筒形培養器）中接種細胞后，在轉瓶的持續旋轉作用下培養細胞，這樣細胞能夠交替接觸空氣及培養液，獲取良好的傳熱條件，傳質條件轉瓶培養的主要特點是結構簡單、無需投入過量資金及設備、技術較為成熟，同時這一系統具備良好的重復性，僅僅需要對轉瓶數量增加以實現放大。但是轉瓶培養系統也存在一定的缺點：即需要占據較大的空間，勞動強度較大，單位體積僅可提供較小的細胞生長表面積，同時其細胞生長密度并不高，在培養過程中無法實現對環境條件的有效監測及控制。目前，常見的轉瓶培養系統可以分為二氧化碳培養箱及轉瓶機。

1.4.2 反應器貼壁培養系統

在應用反應器貼壁培養系統時，細胞主要在固定表面貼附并生長，在攪拌作用下細胞不會隨著培養液共同流動，基于此，培養液更換較為便利，無需特定的細胞分離及培養液設備，通過灌流培養即可獲取較高的細胞密度，在此基礎之上獲取相關產品；但是在具體應用過程中很難擴大規模，無法對細胞的生長情況直接監控，因而這一系統常用于價值較高、用量少的生物藥品制備。常見細胞貼壁載體主要包括中空纖維、微載體系統及玻璃珠等。能夠培養雜交瘤系統、CHO 細胞等多種系統。另外，利用反應器貼壁培養系統培養細胞時，在接種細胞后貼壁速度極快。

2 懸浮培養

懸浮培養是在反應器內接入細胞，使其自由懸浮生長，或在轉動裝置、震蕩裝置的作用下保證細胞分散懸浮于培養液內的細胞培養方法。懸浮培養技術主要基于微生物發酵技術，一般用于培養非貼壁依賴型細胞。

2.1 生長特性

懸浮培養技術就是分散活體動物組織，對其離心、純化及漂洗后選擇適宜的培養液接種，使細胞在特定條件下懸浮生長。無血清懸浮培養采用已知來源的激素或蛋白質培養細胞，無需后期純化，可簡化操作流程，提升產品質量，近年來已經逐漸成為動物細胞大規模培養的重要研究方向。

2.2 懸浮培養的優點

第一，懸浮培養技術操作簡便，方便定量研究；第二，懸浮培養技術具備良好的傳質及傳氧特性，可幫助細胞充分接觸培養基內氣體及營養物質，便于控制培養條件；第三，懸浮培養技術使用過程中無需附著物；第四，利用懸浮培養法細胞可快速繁殖，可提高產量，同時其各項設備結構相對簡便；第五，在細胞培養過程中無需對其再分散，僅需嚴格按照相關比例做好稀釋工作，便可繼續培養，同時其培養規模方便擴大，可連續提高生產量。即使在連續密閉系統內也可以培養細胞，簡化操作步驟，減少污染。

2.3 懸浮培養的缺點

第一，懸浮培養細胞密度不高，很難進行灌流培養；第二，培養過程中可能存在潛在的致癌風險，在病毒培養過程中容易出現喪失病毒標記的現象，最終導致免疫能力降低；第三，適宜懸浮培養的細胞種類并不多，多數動物細胞適宜采取貼壁培養方式。

3 固定化培養

固定化培養技術就是結合動物細胞及水不溶性載體，在此基礎上培養細胞的方式。固定化培養所培養細胞生長密度高，具備較強的抗污染及抗剪切能力，產物及細胞易分開，方便分離并純化產物。常見的固定化培養方式包括以下幾種：

3.1 吸附法

吸附法就是將細胞吸附于固體吸附劑表面，從而固定細胞的方式。吸附法在應用過程中條件溫和、操作簡便，是研究歷史最為悠久的一種動物細胞固定化培養方法。吸附法也存在一定缺陷，即其載體缺乏足夠的負荷能力，導致細胞極容易脫落。吸附法最為常見的是中空纖維培養及微載體培養。

3.2 包埋法

包埋法就是采用多孔載體，在其中包埋細胞以實現細胞的固定化。包埋法操作條件溫和、負荷量較大、很少出現細胞泄露、操作簡便，具備抗機械剪切的效果。但是其缺點為限制擴散，無法保證全部細胞均處于最佳基質濃度，分子量較大的基質很難向高聚物網絡內部滲透。包埋法一般用于固定非貼壁依賴型細胞，通常采取多孔凝膠載體。

3.3 共價貼附法

共價貼附法就是在共價鍵的作用下將動物細胞固定于固相載體上。共價吸附法能夠降低細胞泄露量，但是在具體應用過程中必須利用化學試劑，而化學試劑可能會影響細胞活性，無法有效保護細胞。

3.4 微囊法

微囊法就是利用親水半透膜包裹細胞，使之處于珠狀微囊中，這樣能夠有效阻止細胞溢出，對營養物質及小分子物質在半透膜上的自由出入不會造成任何影響；在囊內可營造一個與液體培養相似的培養環境，避免細胞受損。采用微囊法所培養細胞可良好生長，同時其培養密度也較高。

3.5 離子/共價交聯法

離子/共價交聯法就是對細胞懸浮液采用雙功能試劑處理，可連接細胞并產生交聯作用，從而實現細胞的固定化培養。但是這種培養方式在具體應用過程中，可能會導致部分細胞死亡，也會造成擴散限制。