花生油中黃曲霉毒素B1的表面增強拉曼光譜快速檢測

張悅湘 李永玉 彭彥昆 馬劭瑾 王威 吳繼峰

（中國農業大學工學院， 北京 100083）

糧油安全一直是國際社會關注的重要問題，其中真菌毒素是較為常見的糧油污染因素[1-2]。目前發現的真菌毒素有400 多種，其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）因其高致癌性而成為人們關注的重點，約有25%的動物死亡是由AFB1 污染所引起[3-7]。油料作物從種植到加工食用油的各環節都受到真菌毒素污染的威脅，其中花生和玉米受AFB1 污染占比尤其高[8-10]，我國食品安全國家標準《食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2017）[11]明確規定花生油和玉米油中AFB1 含量不得超過0.02 mg/kg。

目前，AFB1 的傳統檢測方法有高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）、高效液相色譜-熒光檢測（HPLC-FD）和酶聯免疫吸附（ELISA）法等。傳統方法檢測精度高，但通常需要使用昂貴的儀器設備和復雜的樣品處理過程，不適合大批量樣品的快速篩查和現場檢測。快速檢測方法有電化學生物傳感技術和電化學阻抗譜技術（EIS）等，這些方法檢出限相對較高，只能用于初篩查[12-14]。因此，迫切需要開發靈敏、高效、經濟、快速和穩定的AFB1 檢測方法。表面增強拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）利用局域表面等離子體共振和化學吸附的方法獲得樣品分子結構和官能團的指紋信息，常被應用于痕量檢測。目前，基于SERS 的AFB1 檢測研究多采用適配體探針的間接檢測方法。He 等[15]將SH-cDNA 修飾的Fe3O4@Au 納米花作為捕獲探針，SH-Apt 修飾的Au@Ag 納米球和商用Cy3-Apt 作為報告探針，與SERS 相結合開發了一種高靈敏的花生油中AFB1 檢測體系，線性范圍為1 ng/kg～0.1 mg/kg，檢出限為0.4 ng/kg；Chen 等[16]利用氨基端AFB1 適配體（NH2-DNA1）開發了用于花生油中AFB1 檢測的SERS 適配體傳感器，線性范圍為0.1 μg/kg～0.1 mg/kg， 檢出限為36 ng/kg；Jiao 等[17]通過Hg（II）與AFB1的特異性結合，抑制NH2-Rh-Au@Ag CSNP 傳感器的聚集，CSNP 傳感器拉曼信號降低，從而預測花生油中AFB1 含量，檢測范圍為1×10?4～5×10?3mg/kg，檢出限為3×10?5mg/kg。雖然基于適配體探針的間接檢測方法達到了國家標準所要求的檢測精度，但存在適配體分子合成復雜和成本昂貴等缺陷。對于直接檢測方法，Lin 等[18]將金納米雙錐體（Au NBPs）自組裝到陽極氧化鋁（AAO）的納米孔中，合成了高靈敏度的SERS 基底檢測花生中AFB1，線性范圍為1.5 μg/kg～1.5 mg/kg， 檢出限為0.5 μg/kg；Li 等[19]通過在聚二甲基硅氧烷包覆的陽極氧化鋁（PDMS@AAO）復合基底表面濺射金納米粒子（AuNPs），制備了三維椰菜花狀SERS 基底用于玉米中AFB1 的檢測，線性范圍為0.05～1 mg/kg， 檢出限為1.8 μg/kg。但是，以上直接檢測方法存在SERS 基底制備困難、難以保存以及重現性差等缺陷。此外，目前大多數研究在數據分析方面通常基于單一的拉曼峰進行定量分析，然而目標物的特征峰并不唯一，通過單個峰定量分析會丟失許多重要信息，影響定量分析的準確度。

本研究利用實驗室自行研制的液態樣品自動混勻SERS 光譜采集系統，以花生油中AFB1 為研究對象，銀溶膠為表面增強劑，探究了花生油中AFB1 拉曼信息的直接獲取方法，研究了促凝劑等對花生油中AFB1 的SERS 特征信息的影響，建立了花生油中AFB1 的SERS 光譜定量預測模型，最終實現了花生油中AFB1 的快速定量檢測，為液態食品中真菌毒素污染檢測提供了新的思路和技術參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

實驗室自行研制的表面增強拉曼光譜采集系統[20]；TDZ5-WS 低速臺式離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；XH-C 漩渦混合器（常州朗越儀器制造有限公司）；MYP11-2A 恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器制造有限公司）。

AgNO3（≥99%，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（分析純，現代東方科技發展有限公司）；微孔濾膜（0.22 μm，天津津騰實驗設備有限公司）；AFB1（99%）、檸檬酸鈉（分析純）和碘化鉀（分析純）購于上海麥克林生化科技有限公司。花生油為市售產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

稱取AFB1 標準品1 mg 溶于10 mL 乙腈溶液中，制備濃度為100 mg/L 的AFB1 標準儲備液。取500 μL 標準儲備液加入至花生油中，稀釋，制備AFB1 濃度梯度分別為1、0.8、0.5、0.2、0.1、0.08、0.05 和0.02 mg/kg 的花生油樣品，每個濃度梯度制備8 個樣品，共64 個樣品。

1.2.2 表面增強劑銀溶膠的制備

參考文獻[21]的方法制備銀溶膠，以3000 r/min 離心30 min，去除上清液后，收集濃縮約20 倍的銀溶膠置于玻璃瓶中，在4 ℃下避光保存備用。

1.2.3 促凝劑的制備

分別制備濃度為0.1、0.5、0.8、1、1.2 和1.5 mol/L 的KI 溶液以及濃度為1 mol/L 的NaCl、MgSO4和K2SO4溶液，用于促進增強劑中的銀納米粒子與AFB1 分子的結合，考察促凝劑的種類和濃度對目標物拉曼信號的影響。

1.3 表面增強拉曼光譜采集系統

實驗室自行研制的表面增強拉曼光譜采集系統[20]包括液態樣品自動混勻控制模塊和拉曼光譜信息采集模塊，系統結構如圖1A 所示。所研發的液態樣品自動混勻控制模塊實現了自動進樣、振動混勻和到位檢測功能，保證待測樣品與增強劑、促凝劑自動混勻，并控制試驗中樣品混合吸附的時間，減小人工操作光譜采集的誤差（圖1B）。同時，結合拉曼光譜采集模塊能最大限度地保證激光與樣品的對中性以及激光探頭到樣品距離的一致性。此采集系統減少了包括人為因素在內的諸多因素對于拉曼光譜信號的影響，保證了SERS 檢測程序的標準化和一致性。

圖1 （A）表面增強拉曼光譜采集系統；（B）自動混勻裝置：（1）拉曼探頭，（2）樣品板，（3）振動器，（4）步進電機，（5）旋轉臺，（6）調高旋鈕Fig.1 (A)Surface-enhanced Raman spectrum (SERS) acquisition system; (B)Automatic mixing device:(1)Raman probe,(2)Sample version,(3)Vibrator,(4)Stepper motor,(5)Luggage carousel,(6)Adjustment knob

1.4 花生油中AFB1的SERS光譜信息采集

本研究采用QuEChERS 前處理技術[22]，實現較短時間內有效分離提取花生油中的目標物AFB1，進而獲取花生油基質中的AFB1 拉曼特征信息。首先移取5 mL 待測花生油樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙腈-水（84∶16，V/V），超聲振蕩20 min，6000 r/min 離心10 min，上清液經0.22 μm 有機濾膜過濾后，取3 μL 滴入微量液態樣品自動混勻采樣裝置的樣品槽中，再依次滴加表面增強劑銀溶膠和促凝劑各3 μL，表面增強拉曼光譜采集系統振動混勻6 s 后自動采集光譜信息，每個樣品重復采集3 條光譜，取3 條光譜的平均值作為樣品的原始光譜。

1.5 數據處理與分析

為消除暗電流造成的激光斑點大小、激光功率波動及光程變化等物理因素對拉曼光譜產生隨機噪聲干擾，所有光譜均經過SG（Savitzky-Golay）平滑和標準正態變量變換（Standard normal variate transformation，SNV）預處理。再利用非對稱最小二乘[23]（Asymmetric least squares，ALS）進行基線擬合和背景消除，進一步表征目標物的拉曼光譜。偏最小二乘回歸（Partial least squares regression，PLSR）作為一種有效的多元統計回歸方法被廣泛應用于構建具有眾多高度可變的共線性模型，適合多變量的光譜信息分析。為評估PLSR 模型性能，通過計算校正集均方根誤差（Root mean square error of correction set，RMSEC）、預測集均方根誤差（Root mean square error of prediction set，RMSEP）、交叉驗證集均方根誤差（Root mean square error of cross validation set，RMSECV）、校正集決定系數（Determination coefficient of correction set，R2C）和預測集決定系數（Determination coefficient of prediction set，R2P），以判斷和評估模型性能。

為進一步降低光譜信息中的冗余變量對定量預測模型帶來的干擾，本研究采用CARS、RF 和SPA算法對全光譜信息進行AFB1 的特征變量篩選，以減化模型和降低模型的過擬合，從而提高模型預測的精準性和穩定性。采用MATLAB R2016b（美國MathWorks 公司）和Origin 2021（美國OriginLab 公司）進行計算和圖形繪制。

2 結果與討論

2.1 AFB1的拉曼特征峰的確定

AFB1 標準品的光譜經ALS 扣除背景后，清晰地顯示AFB1 豐富的拉曼特征峰信息，如圖2A 所示，采集的AFB1 標準品拉曼特征位移與Liu 等[24]報道的結果相符。基于實驗室自行搭建的表面增強拉曼光譜系統采集的濃度為1 mg/L 的AFB1 標準儲備液的拉曼光譜如圖2B 所示，其中544 cm?1處特征峰是由C—C—C 環變形產生，694 cm?1處特征峰是由C—H 鍵面內彎曲引起，1249 和1276 cm?1處特征峰分別由C—O 鍵拉伸振動和C—H2對稱振動產生，1626 cm?1處特征峰是由C=C 鍵拉伸振動引起[25-26]。相關研究表明，AFB1 分子中內酯環上的碳原子具有較強的親電性，而銀納米粒子帶電，因此AFB1 可以依靠靜電吸附至銀納米粒子的電負性表面，從而增強拉曼信號[27]。AFB1 標準品與AFB1 標準儲備液的拉曼光譜存在偏移，是由于AFB1 溶于乙腈后分子鍵發生了改變，并且分子吸附至銀納米粒子表面后電子密度分配發生了扭曲，分子鍵的極化率被改變，使得光譜中的波段發生了偏移。

2.2 促凝劑對花生油中AFB1檢出限的影響

在不同濃度AFB1 提取液中依次滴加銀溶膠和促凝劑后，其混合液從棕色轉變為灰黑色，在促凝劑的作用下，銀納米粒子凝聚并形成等離子體熱點，熱點中的等離子體增強電磁場將顯著提高AFB1 的拉曼信號強度，并且不同促凝劑會產生不同的銀納米粒子凝聚態。相關研究表明，NaCl、MgSO4、KI、K2SO4、HCl 和NaOH 等溶液都可以作為促凝劑有效提高目標物的拉曼信號[24]，但是AFB1 分子在強酸或強堿環境中會分解，因此常用的HCl 和NaOH 溶液不能作為AFB1 的促凝劑。對比分析不同促凝劑發現，KI 溶液顯著增強了AFB1 特征信號強度，雜質分子對AFB1 拉曼信號的干擾相對較少（圖3A）。此外，KI 溶液濃度也會影響拉曼光譜信號的強度和穩定性（圖3B），當促凝劑KI 溶液濃度為1.2 mol/L 時，544 cm?1處的AFB1 特征峰增強尤為顯著。其中，圖3 中促凝劑濃度均為加入時的原始濃度。促凝劑濃度過低時，銀納米粒子的熱點形成緩慢，導致檢測時間延長，信號不穩定。當KI 溶液濃度過高時，銀納米粒子團聚速度加快，導致聚合物迅速從溶液中沉淀出來，AFB1 的拉曼特征信號反而下降。

圖3 （A）使用不同促凝劑的AFB1 提取液的SERS 光譜；（B）加入不同濃度KI 溶液的AFB1 乙腈提取液的SERS 光譜Fig.3 (A)SERS spectra of AFB1 acetonitrile extracts using different procoagulants;(B)SERS spectra of AFB1 acetonitrile extracts with different concentrations of KI solutions

基于實驗室自行搭建的表面增強拉曼光譜采集系統，在促凝劑KI 溶液濃度為1.2 mol/L 時，采集了不同濃度花生油中AFB1 提取液的SERS 光譜，如圖4 所示。花生油中AFB1 濃度為0.02 mg/kg 時，544 cm?1處AFB1 拉曼特征峰值等滿足3 倍空白標準差計算原則，因此確定本方法對花生油中AFB1 的檢出限為0.02 mg/kg，可達到國家標準中AFB1 的檢測限。

圖4 不同濃度AFB1 提取液的SERS 光譜Fig.4 SERS spectra of different concentrations of AFB1 extracts

2.3 花生油中AFB1預測模型的建立

基于實驗室自行搭建的表面增強拉曼光譜采集系統采集的原始光譜經SG 平滑和SNV 校正后的光譜如圖5 所示，SG 平滑有效消除了光譜的隨機噪聲，SNV 校正消除了基線漂移對拉曼峰的影響。SG 平滑和SNV 校正后光譜再經ALS 校正消除了熒光基線背景，如圖6 所示，544、691、1278 和1621 cm?1處AFB1 的拉曼特征信號均隨其濃度增加而增強，表明拉曼峰值與AFB1 濃度在一定范圍內具有顯著的正相關性。

圖6 經SG 平滑、SNV 校正和非對稱最小二乘（ALS）基線消除的SERS 光譜Fig.6 SERS spectra with SG smoothing,SNV correction and asymmetric least squares(ALS)baseline cancellation

基于聯合x-y距離的樣本集劃分法（Sample set partitioning based on jointx-ydistance，SPXY）將預處理后的光譜與對應AFB1 的濃度分為校正集與預測集，劃分比例為3∶1，分別建立了544、691、1278 和1621 cm?1處AFB1 拉曼特征峰值與AFB1 濃度的一元線性回歸（Unary linear regression）、多元線性回歸（Multiple linear regression，MLR）和全光譜的PLSR 預測模型，結果見表1。544、691、1278 和1621 cm?1處的AFB1 的拉曼特征峰值均與濃度具有較高的相關性，但依據單個拉曼特征峰的一元線性回歸模型均方根誤差相對較大。利用全光譜信息建立AFB1 的PLSR 定量預測模型顯著優于544、691、1278 和1621 cm?1處的一元線性回歸和MLR 模型，其預測集決定系數R2p為0.9816，RMSEP 為0.04704 mg/kg。結果表明，AFB1 特征峰受溶液極性和基底變化的影響大。如前所述，AFB1 拉曼特征峰出現偏移，利用單一特征峰難以保障其定量檢測的準確性，所以利用全光譜的PLSR 定量預測模型優勢顯著。

表1 一元線性回歸、 MLR和PLSR模型性能比較Table 1 Comparison of performances of unary linear regression, MLR and PLSR models

全光譜中除包含AFB1 分子結構和官能團的指紋信息外，還包含其它多種無關變量，為進一步簡化模型，分別利用CARS、RF 和SPA 算法篩選全光譜信息中AFB1 的特征變量，用于花生油中AFB1 定量PLSR 模型的構建。CARS 算法選擇特征變量過程如圖7 所示，根據RMSECV 最小原則，最終確定采樣次數為43 次，AFB1 特征變量數為13 個。

圖7 競爭性自適應重加權抽樣（CARS）運行次數的影響Fig.7 Impact of the number of competitive adaptive reweighted (CARS) runs

分別通過CARS、RF 和SPA 算法篩選的AFB1 特征變量如圖8 所示，3 種算法篩選的特征變量主要集中在圖8D 中AFB1 標準儲備液的表面增強拉曼特征位移544、691、1278、1307 和1623 cm?1附近。CARS 算法篩選的特征變量除AFB1 拉曼特征峰寬的選擇外，一些強度較弱的信號變化如454 和623 cm?1處的拉曼峰也被識別。此外，300～400 cm?1處的Ag—N 鍵的峰也被選擇，表明分析物AFB1 與增強劑銀溶膠的吸附作用與其濃度具有關聯性[28]；479 和588 cm?1基線處被選擇，可能是因為校正后的光譜基線的變化能夠間接反映分析物的濃度變化。

圖8 （A）CARS、（B）隨機蛙跳算法（RF）和（C）連續投影算法（SPA）3 種特征變量篩選算法確定的AFB1拉曼特征光譜變量；（D）AFB1 標準儲備液的SERS 光譜Fig.8 Raman characteristic spectral variable of AFB1 determined by the three characteristic variable screening algorithms of CARS (A), random frog (RF) (B) and successive projections algorithm(SPA) (C); SERS spectrum of AFB1 standard stock solution (D)

分別基于CARS、RF 和SPA 3 種算法篩選的特征變量建立的花生油中AFB1 定量PLSR 預測模型的預測結果見表2。經變量篩選算法消除大量無關光譜信息后，基于CARS 算法所建立的模型效果最佳，其交叉驗證集均方根誤差RMSECV 僅為0.02566 mg/kg。綜上，相比RF 和SPA 算法，CARS 算法更多地保留了AFB1 分子結構和官能團的指紋信息，有效消除了無關變量，提高了模型預測精度和穩定性。

表2 CARS-PLSR和RF-PLSR和SPA-PLSR模型性能比較Table 2 Comparison of performances of CARS-PLSR, RF-PLSR and SPA-PLSR models

2.4 花生油中AFB1快速檢測系統外部驗證

選取10 個未參與建模的花生油樣品對CARS-PLS 定量預測模型進行外部驗證。花生油中AFB1 含量預測值與理化值的決定系數（R2）為0.9792，均方根誤差（RMSE）為0.04426 mg/kg，如圖9 所示。結果表明，利用SERS 結合CARS-PLS 能夠以較高的精度和準確性實現對花生油中AFB1 的快速檢測。

圖9 預測模型外部驗證結果Fig.9 Predicting results of external validation of the model

3 結論

基于實驗室自行研制的液態樣品自動混勻表面增強拉曼光譜采集系統，利用QuEChERS 前處理技術，比較不同促凝劑對花生油中AFB1 SERS 特征信息的影響，確定1.2 mol/L KI 溶液作為促凝劑，獲取了花生油中AFB1 的SERS 特征信號。同時，通過AFB1 標準儲備液等SERS 光譜對比分析確定544、691、1278 和1621 cm?1處拉曼峰為AFB1 的特征拉曼位移，分別建立了一元線性回歸、MLR 和全光譜的PLSR 預測模型，其中利用全光譜的PLSR 定量預測模型優勢顯著。因AFB1 特征峰受溶液極性和基底變化的影響，AFB1 拉曼特征峰產生偏移，所以利用單一特征峰難以保障其定量檢測的準確性。為有效消除無關變量，確保AFB1 分子結構和官能團的指紋信息，分別基于CARS、RF 和SPA 3 種算法篩選特征變量，建立AFB1 定量PLSR 預測模型，其中基于CARS 算法的模型效果最佳，其R2C為0.9961，RMSEC 為0.02213 mg/kg。對此模型進行了外部驗證，其R2為0.9683，RMSE 為0.04426 mg/kg。研究結果表明，本方法檢測過程簡單、耗時較短，可以作為常規真菌毒素檢測的補充方法，為糧油安全檢測和市場監管提供了新思路。