錳摻雜低聚水飛薊超分子網(wǎng)絡(luò)診療一體平臺(tái)的開發(fā)與性能分析

柯月 馬志方 石強(qiáng)*

1（中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所， 高分子物理與化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)春 130022）2（中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)與工程學(xué)院， 合肥 230026）

目前，癌癥仍然是人類健康的主要威脅之一[1-3]，早診斷、早治療是提高癌癥患者生存率的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的癌癥診斷主要包括超聲、磁共振成像（MRI）、CT 掃描和X 射線等成像方式，但這些方法的敏感性差、分辨率低，導(dǎo)致確診不及時(shí)從而錯(cuò)過最佳的癌癥治療窗口；此外，疼痛和侵入性的組織活檢可能會(huì)導(dǎo)致不良的預(yù)后[4]。因此，開發(fā)高效且患者友好的診療一體化納米平臺(tái)成為癌癥納米醫(yī)學(xué)研究的目標(biāo)[5]。

隨著納米醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，治療診斷學(xué)的創(chuàng)新概念和策略備受關(guān)注，具有潛在的臨床轉(zhuǎn)化優(yōu)勢(shì)。診療制劑旨在使用相同的納米藥物的同時(shí)提供即時(shí)診斷和治療[6]，可以監(jiān)測(cè)納米藥物在腫瘤部位的積累，監(jiān)測(cè)其生物分布，根據(jù)特定觸發(fā)釋放藥物，并評(píng)估治療效果，為個(gè)性化醫(yī)療和患者友好的醫(yī)療診斷手段開發(fā)鋪平道路，有利于開發(fā)多模式腫瘤治療策略[7]。多種納米材料如聚合物、磁性納米粒和量子點(diǎn)等已被開發(fā)用于腫瘤檢測(cè)和診斷[8-9]，通過靶向和智能響應(yīng)等策略增強(qiáng)成像靈敏度和分辨率，從而實(shí)現(xiàn)早期診斷和及時(shí)治療，以改善患者的預(yù)后療效[4]。

金屬-酚醛網(wǎng)絡(luò)是基于酚類配體和金屬離子之間強(qiáng)配位作用的組裝體系，因其具有良好的生物相容性、固有的生物降解性、多功能的負(fù)載能力、可控的尺寸和腫瘤微環(huán)境刺激響應(yīng)性等特性備受關(guān)注[10]。金屬-酚醛網(wǎng)絡(luò)繼承了金屬離子和酚類自身特性，具有藥物遞送[11]、生物成像診斷[12]以及治療[13]等多種功能。錳離子（Mn2+）是一種優(yōu)良的磁共振成像（MRI）造影劑，已有多種錳基納米材料被開發(fā)用作納米造影劑[14]。此外，Mn2+還具有化學(xué)動(dòng)力學(xué)、免疫治療和調(diào)控腫瘤微環(huán)境等生理特性，能用于腫瘤治療材料的制備[15-16]。本研究將甲醛縮合的多酚類抗腫瘤活性藥物水飛薊低度聚合后引入錳離子源（MnCl2），形成新的配位交聯(lián)點(diǎn)，在聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的輔助下，采用一鍋法制備了PVP-低聚水飛薊-錳三組分組裝的金屬-酚醛超分子網(wǎng)絡(luò)納米結(jié)構(gòu)（PSM）。本方法制備條件簡(jiǎn)單，可以通過控制投料比調(diào)控納米結(jié)構(gòu)的形貌尺寸，并且能夠負(fù)載小分子藥物；同時(shí)，PSM 在酸性環(huán)境下能發(fā)生響應(yīng)性降解，因此可用于智能響應(yīng)性遞送系統(tǒng)開發(fā)[17]。基于此，本研究通過一鍋法制備了PVP-低聚水飛薊-錳三組分組裝的金屬-酚醛超分子網(wǎng)絡(luò)納米結(jié)構(gòu)（PSM），采用多種方法對(duì)其結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了表征，并著重分析了其診斷成像和抗腫瘤活性。PSM 納米結(jié)構(gòu)的制備以及用于腫瘤診療示意圖見圖1。

圖1 PSM 納米結(jié)構(gòu)制備以及診斷治療的示意圖Fig.1 Schematic diagram of preparation, diagnostic and treatment of PSM nanostructure

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Zetasizer Nano ZS 納米粒度分析儀（英國(guó)馬爾文公司）；JEOL JEM-2800 高分辨透射電子顯微鏡（日本日立公司）；Vertex 70 傅里葉變換紅外光譜儀、D8 Advance X 射線衍射儀（德國(guó)布魯克公司）；X 射線光電子能譜（日本島津公司）；TGA 400 熱失重分析（美國(guó)鉑金埃爾默公司）；SPECTRO 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，德國(guó)斯派克公司）；Nano Drop 2000 紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛科學(xué)公司）；M7 小動(dòng)物核磁共振成像系統(tǒng)（以色列生命科學(xué)初創(chuàng)公司）；Synergy 酶標(biāo)儀（美國(guó)安捷倫公司）。

MnCl2·4H2O（分析純）、二甲基甲酰胺（DMF，分析純）和氨水（25%）（西隴科學(xué)公司）；水飛薊賓（98%，上海源葉生物有限公司）；PVP（分子量55000）和羅丹明B 6G（RB，99%）（西格瑪奧德里奇試劑公司）；甲醛（37%，麥克林試劑公司）；噻唑藍(lán)（MTT，98%，阿拉丁試劑公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PSM納米結(jié)構(gòu)的制備

利用酚醛縮合反應(yīng)[18]制備PSM 納米結(jié)構(gòu)。將0.5 mL 水飛薊DMF 溶液（200 mg/mL）加入到4.5 mL乙醇溶液中， 攪拌均勻。在持續(xù)攪拌下分別加入18.5 mL PVP 溶液（150 mg）和0.225 mL 氨水，待溶液由淺綠色變?yōu)闇\黃色后，加入0.19 mL 甲醛溶液（37%），室溫條件反應(yīng)24 h。向上述溶液中分別加入40、50 和65 mg MnCl2·4H2O， 室溫下持續(xù)勻速攪拌24 h，16000 r/min 離心30 min， 收集不同水飛薊-MnCl2質(zhì)量投料比（2.5∶1、2∶1 和1.5∶1）的沉淀并用去離子水洗滌3 次， 產(chǎn)物在50 ℃烘干過夜， 于陰涼處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 模型藥物RB的負(fù)載

通過物理吸附方式負(fù)載模型藥物RB。向5 mL 1 mg/mL RB 溶液中加入1 mg PSM 納米結(jié)構(gòu)，避光持續(xù)攪拌12 h，16000 r/min 離心30 min， 得到PSM@RB，用去離子水洗滌3 次，測(cè)定PSM@RB 的UV-Vis 吸收光譜。

分別配制0、1.5625、3.125、6.25 和12.5 μg/mL 的RB 溶液，測(cè)定其在525 nm 處吸光度，并繪制濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。保留離心過程中的上清液，測(cè)定其在525 nm 處吸光度，并根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中RB 的質(zhì)量，根據(jù)公式（1）和（2）分別計(jì)算載藥量（DLC）和載藥率（DLE）：

其中，mRB為投入RB 的總量（mg），ms為上清液中RB 的質(zhì)量（mg），mtotal為載藥納米粒的質(zhì)量（mg）。

1.2.3 PSM納米結(jié)構(gòu)體外降解與藥物釋放

通過透析法評(píng)估PSM 納米結(jié)構(gòu)的酸響應(yīng)降解行為。將1 mL 5 mg/mL PSM 納米結(jié)構(gòu)分散液分別在pH=7.4 和5.5 的50 mL PBS 緩沖溶液中進(jìn)行透析（透析袋截留分子量為3500），置于搖床上，于37 ℃振蕩（30 r/min）， 在0、2、8.5、15 和24 h 時(shí)間點(diǎn)取樣，通過ICP-MS 法測(cè)定透析液中錳元素的釋放量。

通過離心法測(cè)定RB 吸光度變化評(píng)估納米結(jié)構(gòu)藥物釋放行為。將1 mL PSM@RB（2 mg）分散液分別加到pH=5.5 或7.4 的PBS 緩沖液（19 mL）中，置于搖床上振蕩（30 r/min）， 分別在0、1、5.5、13、20 和36 h 等時(shí)間點(diǎn)取樣，16000 r/min 離心10 min， 測(cè)定上清液于525 nm 處的吸光度。

1.2.4 磁共振成像(MRI)性能測(cè)定

對(duì)體外PSM 納米結(jié)構(gòu)的酸響應(yīng)條件下的MRI 成像性能進(jìn)行評(píng)估，為了模擬腫瘤部位酸性環(huán)境，按照Mn2+濃度分別配制5 組濃度梯度（0、0.0125、0.025、0.05 和0.1 mmol/L）的PSM 納米結(jié)構(gòu)分散液，置于終體積為1 mL 的pH=7.4 和6.5 的PBS 緩沖體系中，搖床振蕩孵育24 h（30 r/min）， 通過小動(dòng)物磁共振成像系統(tǒng)（1T MRI）分別測(cè)定溶液的T1 加權(quán)MRI 成像性能和T1 弛豫時(shí)間。

建立4T1 小鼠乳腺癌背部荷瘤模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[19]。當(dāng)腫瘤達(dá)到約120～150 mm3時(shí)，以25 mg/kg錳劑量分別向小鼠尾靜脈注射MnCl2溶液和PSM 納米結(jié)構(gòu)分散液，在注射后0、1、2、6、12 和24 h 等特定時(shí)間點(diǎn)采用磁共振成像儀對(duì)小鼠體內(nèi)T1 MRI 成像效果進(jìn)行評(píng)估。

1.2.5 體外抗癌活性測(cè)定

通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)估PSM 納米結(jié)構(gòu)的體外抗癌活性。將小鼠乳腺癌4T1 細(xì)胞復(fù)蘇，接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（接種密度為每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞），生長(zhǎng)至完全貼壁。分別加入200 μL 不同濃度梯度（0、6.25、12.5、25、50 和100 μg/mL）的水飛薊（S）、MnCl2（M）、水飛薊-MnCl2混合液（SM）和PSM 納米結(jié)構(gòu)完全培養(yǎng)基分散液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去上清液，各孔分別加入MTT 試劑反應(yīng)4 h， 測(cè)定其在490 nm 處的吸光度。細(xì)胞存活率（Cell viability）根據(jù)公式（3）計(jì)算。

其中，ODtest為待測(cè)樣品孔的吸光度，ODcontrol為對(duì)照組僅加入細(xì)胞和空白培養(yǎng)基的吸光度，ODblank為未加細(xì)胞的空白孔的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 PSM納米結(jié)構(gòu)的粒徑與形貌分布

水飛薊與MnCl2不同投料質(zhì)量比得到的PSM 的透射電鏡（TEM）圖如圖2A 所示。當(dāng)水飛薊與MnCl2投料質(zhì)量比為2.5∶1 時(shí)，得到了粒徑約為80 nm 的球形納米粒子，顆粒邊緣粗糙有毛刺，粒子之間有粘連。這可能是由于在堿性溶劑中，水飛薊經(jīng)甲醛縮合后的低聚物與加入的Mn2+發(fā)生配位作用，以Mn2+為交聯(lián)點(diǎn)生長(zhǎng)成無定型球狀。當(dāng)投料比為2∶1 時(shí)，納米粒的尺寸增大，形成邊緣更清晰的均一球體。投料比增至1.5∶1 時(shí)，球形納米粒之間發(fā)生聚集，出現(xiàn)更大粒徑的橢圓形納米結(jié)構(gòu)，粒徑分布范圍更廣。TEM圖表明，MnCl2的添加量對(duì)納米球體形成具有重要的作用，PSM 納米結(jié)構(gòu)可能是由多個(gè)超小無定型納米粒子聚集組裝形成的。進(jìn)一步對(duì)投料比為2∶1 的PSM 納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行高分辨透射電鏡表征（圖2B），可見碳（C）、氮（N）、氧（O）以及錳（Mn）元素均勻分布在PSM 納米微球球體表面，進(jìn)一步證實(shí)了PSM 納米結(jié)構(gòu)是通過Mn2+與低聚水飛薊酚羥基絡(luò)合交聯(lián)生長(zhǎng)成均一的球體結(jié)構(gòu)。

圖2 PSM 納米結(jié)構(gòu)的形貌與元素分布：（A）水飛薊與氯化錳投料比不同時(shí)PSM 納米結(jié)構(gòu)的透射電鏡圖，標(biāo)尺為200 nm；（B）水飛薊與氯化錳投料比2∶1 的PSM 納米結(jié)構(gòu)元素分布Fig.2 The morphology and structure of PSM nanostucture: (A) Transmission electron microsphere (TEM)images of PSM with different feeding ratio of silymarin to MnCl2,scale bar is 200 nm;(B)Elemental distribution of PSM nanoparticles with feeding ratio of 2∶1 of silymarin to MnCl2

進(jìn)一步通過納米粒度儀測(cè)定了采用不同水飛薊-MnCl2投料質(zhì)量比制得的納米結(jié)構(gòu)的粒徑與表面電勢(shì)變化，結(jié)果如表1 所示。隨著MnCl2質(zhì)量增加，PSM 納米結(jié)構(gòu)的水合粒徑逐漸增大，當(dāng)投料比從2.5∶1變化到1.5∶1 時(shí)，納米粒子粒徑從78.0 nm 增至156.3 nm；納米粒子的表面電位呈負(fù)電位，并略有降低。

表1 水飛薊與氯化錳不同質(zhì)量投料比制備的PSM納米結(jié)構(gòu)的粒徑與電勢(shì)Table 1 Size and Zeta potential of PSM nanoparticles prepared with different feed ratios of silymarin and MnCl2

以上結(jié)果表明，可以通過改變離子源MnCl2的比例來調(diào)整PSM 金屬-酚醛超分子網(wǎng)絡(luò)納米微球的尺寸。制備PSM 金屬-酚醛超分子網(wǎng)絡(luò)納米結(jié)構(gòu)時(shí)，水飛薊與MnCl2最佳質(zhì)量比為2∶1。由此，通過簡(jiǎn)單的一鍋法制備了PSM 納米結(jié)構(gòu)。

2.2 PSM納米粒結(jié)構(gòu)的性質(zhì)表征

PSM 的傅里葉變換紅外（FTIR）光譜圖見圖3A。紅外光譜中出現(xiàn)水飛薊的多酚苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)峰（1588 和1512 cm?1）、碳氧鍵C—O 的伸縮振動(dòng)峰（1228 cm?1）以及苯環(huán)指紋區(qū)C—H 鍵面外彎曲振動(dòng)峰（820 cm?1）， 說明制備的PSM 納米結(jié)構(gòu)由低聚水飛薊與PVP 組裝[20-21]。采用UV-Vis 吸收光譜測(cè)定了PSM 的吸收峰變化（圖3B），水飛薊溶液的最大吸收峰在300 nm 處，PSM 納米結(jié)構(gòu)在240 nm 處出現(xiàn)了新的尖銳吸收峰，這可能是低聚水飛薊苯環(huán)及共軛體系π-π*或n-π*躍遷導(dǎo)致的。同時(shí)，PSM 納米結(jié)構(gòu)在340～500 nm 之間出現(xiàn)寬帶吸收峰，這可能是Mn2+與低聚水飛薊配位后形成的電子遷移吸收譜帶。以上結(jié)果證實(shí)水飛薊分子經(jīng)甲醛縮合低度交聯(lián)后通過與Mn2+配位組裝形成了金屬-酚醛超分子網(wǎng)絡(luò)納米結(jié)構(gòu)PSM。

圖3 PSM 納米結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)與組成表征：（A）PSM 納米結(jié)構(gòu)的紅外吸收光譜；（B）紫外-可見吸收光譜；（C）X 射線衍射（XRD）譜圖；（D～E）PSM 納米結(jié)構(gòu)以及Mn 2p 的X-射線光電子能譜（XPS）圖；（F） 熱失重（TGA）分析PSR：未摻錳的低聚水飛薊Fig.3 Characterization of the structure and composition of PSM nanostructure: (A) Fourier transform infrared(FTIR)spectra of PSM;(B)UV-Vis absorption spectra of PSM and silymarin;(C)X-ray diffraction(XRD)spectra;(D–E)X-ray photoelectron spectroscopy(XPS)spectra of PSM and Mn 2p;(F)Thermogravimetric analysis(TGA)PSR: silymarin oligomers without manganese doping

采用XRD 測(cè)定了不同材料的晶體結(jié)構(gòu)（圖3C），其中，水飛薊具有小分子晶體強(qiáng)烈的特征衍射峰，而在PSM 納米結(jié)構(gòu)中此特征峰消失，說明PSM 納米結(jié)構(gòu)可能是以各組分無定型的混合物形式存在的[22-23]。為了進(jìn)一步探究PSM 納米結(jié)構(gòu)的元素分布，測(cè)定了物質(zhì)的X-射線光電子能譜（XPS）圖（圖3D和圖3E）。由圖3D 的XPS 譜可知，PSM 納米結(jié)構(gòu)中存在C、N、O、Mn 元素，與高分辨透射電鏡結(jié)果（圖2B）一致。在PSM 的Mn 2p 譜（圖3C）中，Mn 元素位于641.6 和653.1 eV 處的2 個(gè)峰與Mn3O4的結(jié)合能一致，表明Mn 可能是通過與O 原子配位的方式形成超分子網(wǎng)絡(luò)配位交聯(lián)點(diǎn)。通過ICP-MS 和熱重分析（TGA）進(jìn)一步測(cè)定PSM 納米結(jié)構(gòu)的成分組成（圖3F）。采用ICP 測(cè)得Mn 元素含量約為25.3%，由TGA 得到Mn 組分含量約為27.1%，二者測(cè)得結(jié)果基本一致。通過未摻Mn 的低聚水飛薊（PSR）的TGA曲線計(jì)算，PSM 納米結(jié)構(gòu)中水飛薊組分含量約為31.8%。

2.3 PSM藥物釋放與降解

測(cè)定了模型藥物RB 的紫外-可見吸收光譜（圖4A），根據(jù)其在525 nm 處的最大吸收峰繪制濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4B）。負(fù)載RB 后的納米結(jié)構(gòu)（PSM@RB）在525 nm 處出現(xiàn)RB 對(duì)應(yīng)的特征吸收峰（圖4A），表明PSM 納米結(jié)構(gòu)成功負(fù)載模型藥物RB。根據(jù)吸收峰強(qiáng)度以及RB 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到RB 的DLC 和DLE 分別為23.4%和4.7%。

圖4 PSM 納米結(jié)構(gòu)的藥物負(fù)載以及體外酸響應(yīng)釋放和降解：（A）負(fù)載RB 后紫外-可見光吸收光譜；（B）RB 的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；（C）PSM@RB 在不同pH 下的藥物釋放曲線；（D）PSM 納米結(jié)構(gòu)在不同pH值下降解釋放Mn 的曲線Fig.4 Drug loading and in vitro acid responsive release and degradation properties of PSM nanostructure:(A) UV-Vis spectra of PSM; (B) Standard concentration curve of Rhodamine B (RB); (C) Drug release curve of PSM@RB at different pH values; (D) Degradation release curves of Mn from PSM at different pH Values

通過測(cè)定PSM@RB 樣品在不同pH 值下的藥物釋放以及Mn 釋放曲線考察其酸降解性質(zhì)。在酸性磷酸鹽緩沖液（pH=5.5）中，RB 在36 h 內(nèi)的釋放量為71.5%，而在中性條件下，RB 的釋放量?jī)H為50.9%（圖4C），說明PSM 納米結(jié)構(gòu)具有在酸性條件下的藥物釋放性質(zhì)。由于腫瘤部位在代謝過程中呈現(xiàn)弱酸性，因此PSM 納米結(jié)構(gòu)有利于在腫瘤病灶部位釋放負(fù)載藥物[24]。ICP-MS 測(cè)定Mn 元素的釋放結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了酸響應(yīng)性和可降解特性（圖4D）。當(dāng)pH 值從5.5 上升到7.4 時(shí)，Mn 在24 h 內(nèi)釋放量從48.5%下降至10.7%，這證明PSM 納米結(jié)構(gòu)能特定響應(yīng)酸性微環(huán)境發(fā)生降解。以上結(jié)果表明，PSM 納米結(jié)構(gòu)能夠通過酸響應(yīng)性降解實(shí)現(xiàn)藥物遞送目的。

2.4 PSM納米結(jié)構(gòu)的MRI性能分析

將含有不同Mn2+濃度梯度的PSM 納米結(jié)構(gòu)分散在不同緩沖體系（pH=7.4 和6.5）中孵育24 h， 通過磁共振成像儀進(jìn)行T1 加權(quán)成像。如圖5A 所示，隨著Mn2+濃度增加，T1 信號(hào)逐漸增強(qiáng)，證明PSM 納米結(jié)構(gòu)MRI 成像具有濃度依賴性；同時(shí)，在酸性環(huán)境中，T1 加權(quán)圖像信號(hào)也較中性環(huán)境略有增強(qiáng)，這可能是酸性條件下納米結(jié)構(gòu)發(fā)生降解快速釋放的順磁性Mn2+引起的[25]。此外，根據(jù)不同梯度濃度的PSM 納米粒結(jié)構(gòu)的T1 弛豫時(shí)間，測(cè)定了弛豫率r1（1/T1），如圖5B 所示，在酸性條件下，r1從8.8 L/（mmol·S）升至10.1 L/（mmol·S）。體外MRI 成像結(jié)果表明，制備的PSM 納米結(jié)構(gòu)具有酸響應(yīng)的腫瘤診斷成像的造影劑潛能[24]。

圖5 PSM 納米結(jié)構(gòu)體外和體內(nèi)MRI 成像性能測(cè)定：（A～B）不同濃度梯度的PSM 分散液的T1 加權(quán)成像以及對(duì)應(yīng)的弛豫率r1（緩沖體系的pH 值分別為7.4 和6.5，濃度單位為mmol/L）；（C）4T1-荷瘤小鼠分別注射MnCl2 和PSM 溶液后在不同時(shí)間點(diǎn)的T1 加權(quán)成像Fig.5 Measurement of MRI performance of PSM nanostructure in vitro and in vivo:(A–B)T1 weighted imaging of different concentrations of PSM dispersion and corresponding T1 relaxation rate r1 (pH at 7.4 and 6.5,respectively);(C)T1 weighted imaging of 4T1-tumor bearing mice injected with MnCl2 and PSM formulations at different time points

對(duì)MnCl2和PSM 在4T1 荷瘤小鼠體內(nèi)MRI 的成像能力進(jìn)行評(píng)估（圖5C）。靜脈注射MnCl2溶液后，荷瘤小鼠體內(nèi)T1 加權(quán)成像在2 h 達(dá)到最強(qiáng)，主要富集在肝臟及腎臟部位，在腫瘤部位信號(hào)較弱；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，信號(hào)降低，注射24 h 后，在腎臟部位信號(hào)顯著降低，這表明MnCl2在小鼠體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短，容易被肝腎清除。對(duì)比MnCl2處理的小鼠，注射PSM 溶液的小鼠腫瘤部位具有明顯的T1 信號(hào)富集，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，在12 h 強(qiáng)度達(dá)到最大，表明PSM 納米粒在腫瘤部位發(fā)生了酸響應(yīng)釋放Mn2+，特異性增強(qiáng)了病灶部位成像效果。在24 h 體內(nèi)的T1 信號(hào)仍然沒有明顯變化，說明PSM 納米結(jié)構(gòu)具有更長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。上述體內(nèi)外MRI 結(jié)果表明，制備的PSM 納米結(jié)構(gòu)具有酸響應(yīng)激活MRI 以及體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)的特性，有望在腫瘤診斷成像以及腫瘤治療過程的監(jiān)測(cè)中廣泛應(yīng)用[26]。

2.5 PSM納米結(jié)構(gòu)的體外抗腫瘤活性

利用4T 小鼠乳腺癌細(xì)胞研究PSM 納米結(jié)構(gòu)的體外抗腫瘤活性，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT 法）測(cè)定PSM 納米結(jié)構(gòu)對(duì)4T1 小鼠乳腺瘤細(xì)胞的殺傷力，結(jié)果見圖6。

圖6 不同濃度的制劑處理的4T1 細(xì)胞存活率：（A）水飛薊；（B）MnCl2 溶液；（C）水飛薊-MnCl2 混合溶液；（D）PSM 納米結(jié)構(gòu)各組分實(shí)際濃度按照PSM 納米結(jié)構(gòu)質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的百分含量計(jì)算（水飛薊：31.8%；Mn2+：27.1%）Fig.6 Cell viability of small molecules and PSM at different concentration levels: (A) Silymarin; (B) MnCl2 solution; (C) Silymarin-MnCl2 mixed solution; (D) PSM nanoparticlesThe actual concentration of each component is calculated as the percentage corresponding to the mass concentration of PSM nanostructures (Silymarin: 31.8%；Mn2+: 27.1%)

對(duì)于不同小分子藥物組處理的4T1 小鼠乳腺瘤細(xì)胞，藥物濃度在25 μg/mL 以下時(shí)基本沒有毒性，細(xì)胞存活率均在80%以上。藥物濃度升至50 μg/mL 時(shí)，MnCl2和水飛薊-MnCl2混合溶液處理的實(shí)驗(yàn)組4T1小鼠乳腺瘤細(xì)胞存活率略有降低，低于80%，顯示出輕微的細(xì)胞毒性，這主要是由于高濃度Mn2+的輕微抗癌活性導(dǎo)致的。對(duì)比其它實(shí)驗(yàn)組，PSM 在濃度為6.25 μg/mL 時(shí)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，而且隨著濃度增大，4T1 小鼠乳腺瘤細(xì)胞存活率下降幅度增大，細(xì)胞殺傷力更強(qiáng)；當(dāng)PSM 濃度達(dá)到100 μg/mL 時(shí)，4T1 小鼠乳腺瘤細(xì)胞存活率為56%。PSM 納米結(jié)構(gòu)的抗腫瘤活性可能來自于兩方面：（1）納米結(jié)構(gòu)中水飛薊以低聚物的形式存在，相較于小分子單體，具有更強(qiáng)的抗癌活性[27]；（2）來自于PSM 納米結(jié)構(gòu)的Mn2+能夠通過多種抗腫瘤通路激活誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的抗癌活性[28]。

3 結(jié)論

通過簡(jiǎn)單的一鍋法制備了PVP-低聚水飛薊-錳3 種組分組裝的金屬-酚醛超分子網(wǎng)絡(luò)納米結(jié)構(gòu)PSM，其錳含量達(dá)25.3%，并且具有酸性響應(yīng)降解性質(zhì)，可在模擬腫瘤微酸性環(huán)境中發(fā)生降解釋放Mn2+，并實(shí)現(xiàn)模擬藥物的高效遞送，具有潛在的載體應(yīng)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此材料在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的MRI 性能。對(duì)于荷瘤小鼠，制備的PSM 納米結(jié)構(gòu)在體內(nèi)具有較長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間（＞24 h）。此外，4T1 小鼠乳腺瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，PSM 納米結(jié)構(gòu)具有抗腫瘤活性，100 μg/mL 時(shí)4T1 小鼠乳腺瘤細(xì)胞存活率低至56%。本工作對(duì)于腫瘤治療和腫瘤監(jiān)測(cè)具有參考價(jià)值，為構(gòu)建診療一體納米材料的研究工作提供了思路。