異丁?；疞-纈氨酸功能化環糊精手性分離材料的制備和性能評價

胡思雨 王雨楠 徐佳碧 李媛 馬驍飛 王勇* 肖殷

（天津大學 理學院1， 化工學院2， 天津 300350）

手性作為物質的一種本質屬性，廣泛存在于自然界中，構成生命體的氨基酸、蛋白質和核酸等分子都具有手性。當手性藥物作用于生物體時，受體分子對構象相反的對映體通常表現出差異性的作用結果[1]。目前，用于臨床的人工合成藥物約有2000 種，而其中近50%為外消旋體藥物，因此，探索能夠有效拆分手性對映體的新材料具有重要意義[2-3]。

環糊精（CD）是一類超分子化合物，具有疏水的內腔和親水的外緣。CD 作為一種良好的手性選擇劑，具有空腔結構及手性中心，能夠與大量手性分子形成“主客體”包合物[4-5]。因此，CD 在手性拆分領域應用廣泛[6]。然而，僅依靠CD 有限的識別位點進行手性拆分的效果并不理想?，F有研究雖然已經建立了一系列CD 功能化改性方法，但在CD 手性分離性能方面依然存在較大的提升空間[7-11]。氨基酸作為天然的手性分子[12-13]，具有偶極-偶極、π-π及氫鍵等作用位點。在早期的研究中，研究人員將L-甘氨酸、L-酪氨酸等天然氨基酸修飾到CD 上，并探討了其對丹磺酰化氨基酸對映體和硝基苯酚等異構體的分離，結果表明，引入氨基酸不會破壞CD 的包合能力，同時能夠提供更多與對映體相互作用的機會，但這僅增加了手性丹磺酰化氨基酸的保留時間，而對其分離選擇性影響不大[14-15]，這可能是由于天然氨基酸的作用位點難以與環糊精空腔形成好的協同效應，采用衍生化的氨基酸改性CD 骨架有望獲得理想的拆分能力[16]。

基于此，本研究在CD 骨架中引入具有手性結構的異丁酰化L-纈氨酸功能團，并利用“巰基-烯”點擊化學反應制備了一種具有全新結構的CD 手性分離材料。相比天然氨基酸，衍生化功能團由于增加了更多的疏水性異丙基及親水性羰基，能夠引入更強的親疏水相互作用、立體作用及氫鍵等作用位點，因此，可獲得良好的手性拆分性能。利用高效液相色譜（HPLC）考察了此材料對黃烷酮和異噁唑啉等多種手性藥物的拆分性能，通過優化分離條件建立了專屬的手性分離體系，同時深入研究了異丁?；疞-纈氨酸功能化CD 對同分異構體的分離能力，成功實現了二甲苯異構體的完全分離，并探索了構效關系，為CD 分離材料的開發提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Hitachi 高效液相色譜儀（日本日立公司）；P10SNXP1 高壓填柱泵（美國Lab Alliance 公司）；FTS3000 傅里葉紅外光譜儀（寧波天美科學儀器有限公司）；TG-DTA8122 熱重分析儀（德國耐馳儀器公司）；Vario EL 有機元素分析儀（德國艾力蒙塔公司）；Bruker ACF400 液體核磁共振譜儀（瑞士布魯克公司）；JEOL JNM ECZ600R 固液核磁共振譜儀（日本電子株式會社）。

纈氨酸、異丁酰氯、三乙胺、N,N-羰基二咪唑（CDI）和NaOH（上海邁瑞爾化學技術有限公司）；濃HCl、無水MgSO4、NH4Cl、β-環糊精（β-CD）、1-烯丙基咪唑、（3-環氧丙氧基丙基）三甲氧基硅烷和（3-巰基丙基）三甲氧基硅烷（天津希恩思生化科技有限公司）；偶氮二異丁腈（AIBN）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和氯型強堿性陰離子交換樹脂（上海麥克林生化科技有限公司）；硅膠（5 μm，10 nm）（日本Fuji 公司）；乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）（天津康科德科技有限公司）。所用化學試劑均為分析純；合成過程用水為去離子水，色譜過程用水為某品牌飲用純凈水。

1.2 實驗方法

固定相材料的具體制備路線如圖1 所示。

圖1 異丁?；疞-纈氨酸功能化環糊精手性固定相（AI-β-CD-Val-IBAm-CSP）的合成路線Fig.1 Synthesis pathway of isobutylated L-valine functionalized cyclodextrin chiral stationary phase(AI-β-CDVal-IBAm-CSP)

1.2.1 異丁?；?L-纈氨酸(Val-IBAm)的制備

根據文獻[17]的方法制備Val-IBAm。將5 gL-纈氨酸與1.72 g NaOH 溶于50 mL 去離子水中，攪拌0.5 h；在冰浴條件下，緩慢滴加5.49 g 異丁酰氯，用2 mol/L NaOH 調節溶液至pH≥9；常溫反應12 h后，在冰浴條件下，用濃HCl 酸化溶液至pH=1，有白色物質析出；繼續攪拌2 h，抽濾，產物于80 ℃真空干燥，得到白色粉末Val-IBAm。

液體核磁表征（1H NMR，400 MHz， CDCl3-d）：5.98～5.96（1 H）， 4.58～4.54（1 H）， 2.48～2.44（1 H），2.28～2.23（1 H）， 1.25～1.17（6 H）， 1.00～0.95（6 H）。

1.2.2 單-6-(1-烯丙基咪唑)-CD-氯化物(AI-β-CD)的制備

根據文獻[18]的方法制備單-6-（1-烯丙基咪唑）-CD-氯化物。

紅外表征（FTIR，KBr）：3337 cm–1（O—H 伸縮振動），2927 cm–1（C—H 伸縮振動），1649 cm–1（C=C伸縮振動），1054 cm–1（C—O—C 對稱伸縮振動）。

液體核磁表征（1H NMR，400 MHz，DMSO-d6）：9.15（1 H），7.76～7.73（2 H）， 6.01～5.33（3 H），4.98～4.85（7 H）， 4.57～3.56（42 H）， 2.34（4 H）。

1.2.3 異丁酰化-L-纈氨酸-烯丙基咪唑-β-環糊精(AI-β-CD-Val-IBAm)的制備

稱取1.0 g AI-β-CD 于25 mL 圓底燒瓶中，用4 mL 無水DMF 溶解（反應液1）。稱取0.5936 g Val-IBAm于25 mL 圓底燒瓶中，加入4 mL 無水DMF 溶解（反應液2）。在冰浴條件下，向反應液2 中緩慢加入0.7710 g CDI，室溫攪拌30 min。最后，將上述體系加入到反應液1 中，氮氣保護條件下于50 ℃反應48 h。反應結束后，冷卻至室溫，用MeOH 透析3 d。透析結束后，旋蒸除去MeOH，產物于50 ℃真空干燥。

1.2.4 巰基硅膠(HS-SiO2)的制備

將3.0 g 活化的硅膠（120 ℃真空干燥過夜）加入到30 mL 無水甲苯中，分散均勻，向反應體系中加入0.75 mL（3-巰基丙基）三甲氧基硅烷，在氮氣保護條件下于120 ℃反應8 h。過濾得到固體粗產物，用丙酮索氏提取12 h， 60 ℃真空干燥。

紅外表征（FTIR，KBr）：3433 cm–1（硅膠中O—H 伸縮振動），1629 cm–1（C=C 伸縮振動），1108 cm–1（C—O—C 對稱伸縮振動）。

1.2.5 異丁?；?L-纈氨酸-烯丙基咪唑-β-環糊精手性固定相(AI-β-CD-Val-IBAm-CSP)的制備

向30 mL 甲醇-去離子水（1∶1，V/V）混合溶劑中加入1.5 g AI-β-CD-Val-IBAm，充分攪拌使其完全溶解；向反應體系中加入2.0 g HS-SiO2和100 mg AIBN，氮氣保護下，在60 ℃下攪拌反應24 h。反應完成后，將反應體系過濾得到粗產物，依次用去離子水、MeOH 和丙酮洗滌，60 ℃真空干燥。

1.2.6 液相色譜柱的填裝

采用經典的高壓勻漿填充法將所制備的手性固定相（CSP）裝入不銹鋼柱（50 mm×4.6 mm I.D.）中，以MeOH 為分散劑。裝填過程持續約60 min， 裝柱壓力約3600 psi （1 psi = 6.895 kPa）。

1.2.7 色譜方法

本研究中采用2 種類型的流動相（MP）：（1）MeOH/H2O；（2）ACN/H2O。所有的流動相及分析物溶液在使用前均經過0.45 μm 濾膜過濾，然后進行超聲脫氣，測試中根據情況調整流動相中不同組分的比例。保留因子（k）、選擇因子（α）和分離度（Rs）分別采用以下公式進行計算：

式中，tR為對映體的保留時間；t0為死 時間，由基線波動所決定。

式中，Wh 為色譜峰的半峰寬。

2 結果與討論

2.1 異丁?；?L-纈氨酸-烯丙基咪唑-β-環糊精的表征

采用FTIR 和1H NMR 對合成的AI-β-CD-Val-IBAm 進行結構表征。在FTIR 光譜（圖2A）中，與AI-β-CD 相比，AI-β-CD-Val-IBAm 在1736 cm–1處出現了C=O 伸縮振動吸收峰，甲基的伸縮振動吸收峰出現在2973 cm–1處，并且在1H NMR 對比圖（圖2B）中，AI-β-CD-Val-IBAm 化學位移在1 ppm 附近的信號峰歸屬于Val-IBAm 上的甲基H，以上結果均證明了Val-IBAm 在AI-β-CD 上的固載。通過1H NMR 進行了Val-IBAm 的取代度的計算（見電子版文后支持信息圖S1）。結果表明，約有5 個Val-IBAm 分子成功修飾于AI-β-CD，并且通過保護CD 的6 位羥基[19]證明了在CD 的大口端和小口端都發生了Val-IBAm 的取代反應（電子版文后支持信息圖S2）。

圖2 AI-β-CD-Val-IBAm（a）和AI-β-CD（b）的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）圖（A）和核磁共振（1H NMR）譜圖（B）Fig.2 (A) Fourier transform infrared (FTIR) spectrum and (B) proton nuclear magnetic resonance (1H NMR)spectrum of AI-β-CD-Val-IBAm (a) and AI-β-CD (b)

2.2 異丁酰化-L-纈氨酸-烯丙基咪-β-環糊精手性固定相的表征

通過FTIR、熱重分析（TGA）、13C NMR 和元素分析對所制備的CSP 進行了表征。在圖3A 中，與SH-SiO2相比，從CSP 的曲線中可以明顯看到2940 cm–1附近的亞甲基伸縮振動吸收峰，證明AI-β-CDVal-IBAm 成功鍵合于SH-SiO2表面。以10 ℃/min 的速率從室溫升溫至800 ℃， CSP 與SH-SiO2的熱失重分別為8.3%和23.9%（m/m），重量損失的差異證明AI-β-CD-Val-IBAm 已被成功固載在硅膠表面（圖3B）。固體13C NMR 譜圖結果表明，相比于SH-SiO2，CSP 在60～110 ppm 處出現了歸屬于CD 糖環上的碳原子的信號峰，170 ppm 處的信號峰則歸屬于羰基上的碳原子（圖3C）。由元素分析結果（見電子版文后支持信息表S1）可知，CSP 中的C、H 和N 的百分含量與SH-SiO2相比均有較大程度提升，并且S 的含量顯著下降，計算得到固定相的環糊精固載量為0.53 μmol/m2，表明通過“巰基-烯”點擊化學可成功制備新型環糊精功能化CSP。FTIR、TGA、13C NMR 和元素分析的結果證明成功制備了新型環糊精固定相。

圖3 HS-SiO2（a）和手性固定相（CSP）（b）的FTIR 圖（A）、熱重分析（TGA）曲線（B）和13C NMR 譜圖（C）Fig.3 (A)FTIR spectrum,(B)thermogravimetric analysis(TGA)curve and(C) 13C NMR spectrum of HS-SiO2(a)and chiral solid phase (CSP) (b)

2.3 色譜行為評價

為探究所制備的AI-β-CD-Val-IBAm-CSP 的色譜分離性能，本研究選取黃烷酮類和異噁唑啉類的手性藥物（對映體結構見電子版文后支持信息圖S3）進行色譜分離實驗，表1 顯示了分析物在最佳流動相條件下的色譜分離結果。探討了溫度和進樣量對CSP 拆分行為的影響，并對CSP 進行了穩定性評價。為了更全面客觀地評估CSP 的分離性能，選擇廣泛應用的商業手性色譜柱（CYCLOBOND I 2000）與本研究制備的CSP 進行比較，充分證明了CSP 優越的拆分性能。此外，此新型環糊精CSP 展現了對二甲苯異構體的完全分離能力，進一步表明其在手性和非手性分離領域具有良好的應用潛能。

表1 手性藥物在CSP上的色譜拆分結果Table 1 Chromatographic separation results of chiral drugs on CSP

2.3.1 黃烷酮類藥物的拆分

黃烷酮類化合物是中草藥中一類手性藥用成分。分別以MeOH-H2O （50∶50，V/V）和ACN-H2O（50∶50，V/V）為流動相（流速均為0.5 mL/min、柱溫均為30 ℃）， 考察了CSP 在不同有機溶劑下的手性拆分性能（電子版文后支持信息圖S4）。實驗結果表明，以ACN-H2O 為流動相時，樣品出峰較快，分離效果較好。在反相高效液相色譜中，ACN 是極性非質子性溶劑，其洗脫能力強于MeOH。因此，后續均以ACN-H2O 為流動相進行實驗。在選定流動相種類的基礎上，考察了流動相比例對AI-β-CD-Val-IBAm-CSP拆分4 種黃烷酮類藥物性能的影響（電子版文后支持信息表S2），最佳流動相條件下的拆分結果見表1，CSP 對4′-羥基黃烷酮和黃烷酮均達到了或接近基線分離，而對于6-甲氧基黃烷酮和7-甲氧基黃烷酮的拆分能力較差（圖4）。由分析色譜結果可知，當使用CSP 進行拆分時，黃烷酮類藥物位于苯并吡喃酮上的取代基會阻礙分析物的保留并削弱拆分效果，而位于苯環上的取代基則能夠促進手性拆分，這主要是因為與CD 的疏水空腔發生“主-客體”包合作用的是苯并吡喃端，因此，苯并吡喃端芳環上的取代基可能成為包合的障礙[20]。此外，4′-羥基黃烷酮的分離度高達2.57，由此推測苯環上對位取代的羥基能夠提供強的氫鍵作用位點，在4′-羥基黃烷酮的色譜拆分過程中具有非常積極的作用。

圖4 4 種黃烷酮類手性藥物在CSP 上的色譜圖（ACN-H2O（20∶80，V/V），0.5 mL/min， 30 ℃）：（A） 4′-羥基黃烷酮；（B） 黃烷酮；（C） 7-甲氧基黃烷酮；（D）6-甲氧基黃烷酮Fig.4 Chromatograms of four flavanone chiral drugs on CSP(ACN-H2O(20:80,V/V),0.5 mL/min,30 ℃):(A) 4′-Hydroxyflavanone ; (B) Flavanone ; (C) 7-Methoxyflavanone; (D) 6-Methoxyflavanone

2.3.2 異噁唑啉類農藥的拆分

異噁唑啉類化合物廣泛應用在醫藥和農業等領域。采用制備的AI-β-CD-Val-IBAm-CSP，分別以MeOH-H2O（50∶50，V/V）和ACN-H2O（50∶50，V/V）為流動相（流速均為0.5 mL/min、柱溫均為30 ℃），對3 種常見的異噁唑啉類化合物進行分離，考察了CSP 在不同種類流動相下對異噁唑啉類藥物的拆分能力（電子版文后支持信息圖S5）。結果表明，以ACN-H2O 為流動相時分離效果較好，后續以ACN-H2O 為流動相進行實驗。考察了流動相比例對AI-β-CD-Val-IBAm-CSP 拆分異噁唑啉類藥物的影響（電子版文后支持信息表S3），最佳流動相條件下的拆分結果列于表1。MDOPh-Ph、4ClPh-Ph 和4MOPh-Ph 這3 種樣品在CSP 上表現出較好的分離效果（圖5），由于疏水包合作用在樣品分離中占主導作用，含有兩個苯環的Ar-Phs 疏水性很強，因此與CSP 形成的包合物穩定，可以形成有效的手性拆分三點作用模型[21]。其中，MDOPh-Ph 和4ClPh-Ph 達到基線分離，4MOPh-Ph 接近基線分離，不同的基團取代在同一位置存在不同的分離結果。

圖5 3 種異噁唑啉類手性藥物在CSP 上的色譜圖：（A） 4ClPh-Ph; （B） MDOPh-Ph; （C） 4MOPh-PhFig.5 Chromatograms of three isoxazolines chiral drugs on CSP:(A)4ClPh-Ph;(B)MDOPh-Ph;(C)4MOPh-Ph色譜條件(Chromatographic conditions):(A)ACN-H2O(30∶70,V/V); (B)ACN-H2O(30∶70,V/V); (C)ACN-H2O(20∶80,V/V);0.5 mL/min, 30 ℃

2.4 溫度和進樣量對CSP拆分行為的影響

以4′-羥基黃烷酮作為測試樣品，保持流動相條件（ACN-H2O （40∶60，V/V），流速為0.5 mL/min，30 ℃）不變，考察了溫度和進樣量對CSP 手性拆分行為的影響（圖6），結果見電子版文后支持信息表S4和S5。隨著溫度升高，α和Rs減小，這是因為分子熱運動增加，削弱了環糊精空腔及其它作用位點與樣品之間的相互作用，導致樣品被快速洗脫。由圖6B 可見，進樣量的多少直觀地反映在色譜峰高。適當增大進樣量可以提高檢測的靈敏度和準確度，但α和Rs會隨進樣量增加而略降。

圖6 溫度（A）和進樣量（B）對CSP 拆分行為的影響（ACN-H2O （40∶60，V/V），0.5 mL/min，30 ℃）Fig.6 Effects of temperature(A)and injection volumn(B)on CSP resolution behavior(ACN-H2O(40∶60,V/V),0.5 mL/min, 30 ℃)

2.5 CSP穩定性評價

為了考察CSP 的穩定性及重現性，以4′-羥基黃烷酮為代表進行長期穩定性實驗。由圖7A 可見，儲存70 d 后，CSP 仍然對4′-羥基黃烷酮表現出良好的分離重現性，說明CSP 具有優異的穩定性。為了進一步考察CSP 在酸堿環境下的穩定性，選取丹磺酰纈氨酸（Dns-val）進行測試，用pH = 3.5 或pH = 9 的流動相以0.5 mL/min 連續沖洗24 h。由圖7B 和圖7C 可見，即使長時間暴露于酸性或堿性流動相后，色譜柱的保留時間、峰形、Rs和α幾乎沒有變化（電子版文后支持信息表S6），說明CSP 具有良好的酸堿穩定性。

圖7 （A）長期穩定性測試：a，初始分離；b，60 d；c，70 d；ACN-H2O（20∶80，V/V），0.5 mL/min， 30 ℃）。（B）酸性環境下穩定性測試：a，初始分離；b，連續沖洗24 h；pH=3.5；MeOH-1%TEAA（80∶20，V/V），pH=3.5，0.5 mL/min， 30 ℃）。（C）堿性環境下穩定性測試：a，初始分離；b，連續沖洗24 h；pH=9；MeOH-1% TEAA （80∶20，V/V），pH=9.0，0.5 mL/min， 30 ℃）Fig.7 (A) Long-term stability test: a, initial separation; b, 60 d later; c, 70 d later; ACN-H2O (20∶80, V/V),0.5 mL/min,30 ℃.(B)Stability test under acid mobile phase:a,initial separation;b,flush continuously for24 h;pH=3.5; MeOH-1% TEAA (80∶20, V/V), 0.5 mL/min, 30 ℃.(C) Stability test under basic mobile phase: a,initial separation; b, flush continuously for 24 h; pH=9.0; MeOH-1% TEAA (80∶20, V/V), 0.5 mL/min, 30 ℃

2.6 與其它色譜柱的對比

比較了AI-β-CD-Val-IBAm-CSP 與商業手性色譜柱（CYCLOBOND I 2000）、文獻中其它手性色譜柱[21]以及氨基酸修飾的CD 色譜柱[15]的識別能力。從電子版文后支持信息表S7 可知，CYCLOBOND I 2000對這7 種物質均不能分離，對比其它手性色譜柱CSP2[22]（15 cm × 4.6 mm）， CSP 對黃烷酮類和異噁唑啉類具有更好的分離效果，證明AI-β-CD-Val-IBAm-CSP 在手性藥物分離中具有良好的應用前景。此外，為了更充分地證明CSP 的優異性能，以L-酪氨酸修飾的CD 固定相TCDS 作為比較對象[15]，通過比較TCDS（15 cm×4.6 mm）和CSP（5 cm×4.6 mm）對丹磺酰纈氨酸和丹磺酰苯丙氨酸的選擇性因子（電子版文后支持信息表S7），發現CSP 表現出與之相當的選擇性，對丹磺酰纈氨酸和丹磺酰苯丙氨酸表現出一定的拆分能力（電子版文后支持信息圖S6），證明了AI-β-CD-Val-IBAm-CSP 的優異性能。

2.7 二甲苯異構體拆分研究

在考察CSP 手性分離性能的同時，進一步嘗試將其用于鄰、間、對-二甲苯異構體的分離。作為化學化工領域極為重要的原材料及中間體，二甲苯異構體的分離被認為是分離難題之一[23]。目前已經有很多材料被用于二甲苯異構體的分離，如金屬有機框架[24]、分子篩[25]和石墨烯量子點[26]等，其中，以CD 衍生物作為固定相、應用色譜分離技術分離二甲苯異構體的研究也引起廣泛關注。本研究通過異丁?；疞-纈氨酸對CD 進行修飾，制備的新型CSP 具備對二甲苯異構體的完全分離能力（圖8），相關數據見電子版文后支持信息表S8。此外，進行了鄰、間、對-二甲苯3 種組分出峰順序的確定（電子版文后支持信息表S9），通過與單一組分樣品的保留時間進行對比，可以確定在CSP 上的出峰先后順序依次為對-二甲苯、間-二甲苯和鄰-二甲苯。推測這些同分異構體的保留能力與其取代基位置有關：鄰-二甲苯的保留時間較長，而對-二甲苯的保留時間較短，表明CSP 對分析物可能具有特異性識別和形狀選擇的能力。CSP 對鄰-二甲苯的保留較強可能是由于鄰-二甲苯的兩個甲基之間的間距最短[27]，使其能夠進入異丁酰化L-纈氨酸修飾后的環糊精空腔；對-二甲苯取代基之間的間距大于間-二甲苯，因此包合相對不穩定，在3 個異構體中保留最弱。

圖8 二甲苯異構體在CSP 上的色譜圖（MeOH-H2O （50∶50，V/V），0.5 mL/min， 30 ℃）Fig.8 Chromatogram of xylene isomers on CSP(MeOH-H2O (50∶50, V/V), 0.5 mL/min, 30 ℃)

3 結論

在CD 骨架中引入異丁?；疞-纈氨酸功能團，并利用“巰基-烯”點擊化學反應合成了一種全新結構的環糊精CSP，采用高效液相色譜對黃烷酮和異噁唑啉兩類手性對映體進行了分離，證實此CSP 具有優異的手性拆分能力。在優化對映體色譜拆分條件的基礎上，進一步探討了相關的手性分離機理?？疾炝藴囟群瓦M樣量對手性拆分效果的影響，評價了此新型CSP 的穩定性。此新型CSP 對二甲苯異構體這類非手性樣品具有完全分離能力。本研究證明了基于CD 的CSP 在手性和非手性分離領域的應用潛能。