多指標綜合評價結合層次分析法優化黃芩微波酒制工藝

李利華,王巍,張一美,趙夢輝,鞠成國,2

(1．遼寧中醫藥大學藥學院,遼寧 大連 116600;2．國家中醫藥管理局中藥炮制技術傳承基地<遼寧>,遼寧 大連 116600)

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根[1]。始載于《神農本草經》[2],亦稱腐腸、妒婦、苦督郵、枯黃芩、子芩、條黃芩[3]。黃芩氣平,性寒,味苦,無毒。歸肺、脾、大腸經[4],大量的研究指出,黃芩的主要功效包括:抗菌、抗炎、抗病毒、抗過敏、抗氧化、抗腫瘤,護肝和神經保護等[5-8]。大量的藥理研究表明,黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮及其苷類化學成分為黃芩中的主要生物活性物質[9]。

由于黃芩性味苦、寒,目前臨床上多采用其炮制品酒黃芩[10]。中醫傳統理論認為“酒制則升”,酒黃芩可借酒的清上焦之力,清除上焦肺熱和四肢膚表之濕熱,黃芩性寒,用辛熱的黃酒炮制,符合寒性緩和的“以熱制寒”學說,既能緩和黃芩的苦寒之性,又能免傷脾陽[11]。歷年以來,《中國藥典》收載的酒制方法均為酒炒法。根據全國炮制規范,各地的炮制也均為酒炒法[12],但是傳統炒制易出現火源不穩定、火候時間可控性差,受熱不均等問題,現代微波炮制技術已被應用于多種中藥的炮制[13],相較于傳統炒制,微波炮制具有似光特性及穿透特性,熱特性,非熱特性等獨特性能(生物效應)使得炮制加熱均勻,并且溫度穩定,智能化程度高,精確度高,易于操作[14]。

本試驗以黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類成分的含量為評價指標[15],采用正交試驗設計結合層次分析法[16],對酒黃芩微波炮制工藝進行優化,以期為解析炮制原理提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器Waters e2695 HPLC高效液相色譜儀;DFT-200型高速萬能粉碎機(購自浙江溫嶺市林大機械有限公司);XMTD-8222型電熱恒溫鼓風干燥器(購自上海精宏實驗設備有限公司); FA-1004B型電子天平(購自上海精密科學儀器有限公司);AE-240型電子分析天平(十萬分之一,購自瑞士梅特勒-托利多公司);S7G88C型微波爐(購自蘇州三星電子有限公司)。

A.混合對照品;B.黃芩生品;C.黃芩傳統酒制品;D.黃芩微波酒制品 1.黃芩苷;2.漢黃芩苷;3.黃芩素;4.漢黃芩素

1.2 試藥黃芩藥材經遼寧中醫藥大學鑒定室李峰教授鑒定為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根。所用對照品黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素(批號分別為B0321A5、O0903AS、J0227AS、M0303AS,均購于大連美侖生物技術有限公司,質量分數均大于98%),漢黃芩苷購于大連美侖生物技術有限公司,其他對照品購于中國藥品生物制品檢定研究院。黃酒(批號:20190202,酒精度10%)購自浙江古越龍山紹興酒股份有限公司,甲醇為色譜純,乙醇、磷酸為分析純,水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 飲片制備

2.1.1 生黃芩飲片取黃芩原藥材除去雜質,置沸水中煮10 min,取出,切成2 mm薄片,于60 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干,即得。

2.1.2 傳統酒黃芩飲片取生黃芩飲片適量,置密閉容器內,加入10%的黃酒(即生黃芩飲片質量的10%,下同)拌勻,悶透,待黃酒被吸盡后,置于鍋中,以文火炒干,取出,放涼,即得。

2.1.3 微波酒黃芩飲片取生黃芩飲片適量,加入10%的輔料黃酒拌勻,置密閉容器內悶潤30 min,單層鋪于密閉容器內,置微波爐托盤上,在300 W功率下,微波5 min,取出,放涼,即得。

2.2 指標成分定量測定

2.2.1 對照品溶液的制備分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量,用甲醇溶解并定容,制備成對照品儲備液。精密移取對照品儲備液適量,甲醇稀釋,搖勻經0.22 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得分別含黃芩苷0.044 mg·mL-1,漢黃芩苷0.021 mg·mL-1,黃芩素0.008 mg·mL-1,漢黃芩素0.008 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備按照《中國藥典》2020年版[1]黃芩項下含量測定方法制備供試品溶液,即取黃芩粉末約0.3 g,精密稱定,加70%乙醇40 mL,水浴回流3 h,冷卻至室溫,過濾,濾液濾至100 mL容量瓶中,容器及濾渣用70%乙醇進行分次洗滌,洗滌液濾入同一個容量瓶內,70%乙醇定容至刻度,搖勻。精密移取1 mL上述供試品溶液,置10 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,經0.22 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得。

2.3 色譜條件色譜柱:Xtimate C18柱;流動相:甲醇(A)-0.2%磷酸水(B)(0～17 min,47%A;17～20 min,47%A→70%A;20～30 min,70%A→100%A);流速:1.0 mL·min-1;PDA檢測波長為:280 nm;樣品進樣量:10 μL;柱溫:30 ℃。

2.4 系統適用性試驗取上述混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液適量,按“2.3”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,詳見圖1。由圖1可知,各色譜峰均與基線分離,分離度均大于1.5。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察將對照品儲備液稀釋成系列不同濃度的對照品溶液,按“2.3”項下色譜條件進樣測定,以峰面積為縱坐標(Y),以各待測成分進樣量為橫坐標(X),得到黃芩苷回歸方程Y=3 221 445.9X-95 126,r=0.999 8,漢黃芩苷回歸方程Y=1 647 552.4X-26 610.8,r=0.999 7,黃芩素回歸方程Y=1 083 325X-5 468.8,r=0.999 9,漢黃芩素回歸方程Y=1 081 090X-5 101,r=0.999 7,表明黃芩苷在0.008 7～0.435 0 μg,漢黃芩苷0.004 2～0.210 0 μg,黃芩素在0.001 6～0.080 0 μg,黃芩素在0.001 6～0.080 0 μg進樣范圍內與色譜峰面積呈良好的線性關系。

2.5.2 精密度試驗精密吸取混合對照品溶液,按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次,計算得黃芩苷,漢黃芩苷,黃芩素,漢黃芩素峰面積的RSD分別為:0.18%、0.57%、0.20%、0.44%,n=6,表明該儀器精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗精密吸取同一供試品溶液,照“2.3”項下色譜條件,在樣品制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣,黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD分別為:0.69%、0.65%、1.06%、1.64%,n=6,表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.5.4 重復性試驗精密稱取同一黃芩供試品粉末6份,按2.3項下方法制備供試品溶液,進樣測定,計算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均含量分別為:12.07%、4.76%、2.31%、0.23%;RSD分別為:1.66%、1.37%、0.78%、1.17%(n=6),表明該方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗精密稱定已知含量的黃芩粉末6份,各0.15 g,按對照品加入量∶樣品中量≈1∶1的比例加入對照品,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,進行測定,計算各成分加樣回收率,結果:黃芩苷平均加樣回收率為102.22%,RSD為1.20%;漢黃芩苷平均加樣回收率為100.50%,RSD為1.76%;黃芩素平均加樣回收率為100.83%,RSD為2.10%;漢黃芩素平均加樣回收率為98.48%,RSD為1.41%。4種黃酮類化合物的加樣回收率均在規定的回收限度內,表明該方法的加樣回收率良好。

2.6 炮制工藝優化

2.6.1 多指標綜合加權評分法根據層次分析法(AHP)原理,利用Yaahp v10.3應用軟件以綜合評分OD值作為決策目標,以各個指標的權重系數作為方案層,并建立判斷矩陣,判斷矩陣一致性比率(CR)<0.1,表明判斷矩陣一致性良好,得到的權重系數是合理和有效的,不存在邏輯混亂,結果見表1。分別給予黃芩苷0.6,漢黃芩苷0.2,黃芩素0.1,漢黃芩素0.1的權重系數,加權綜合評分,計算綜合OD值。

表1 關于工藝指標的準則層判斷矩陣

綜合評分=(60×X/Xmax+20×Y/Ymax+10×W/Wmax+10×Z/Zmax)×100%,其中X為黃芩苷含量,Y漢黃芩苷含量,W為黃芩素含量,Z為漢黃芩素含量,綜合評分越高表示樣品質量越好。

2.6.2 單因素考察

2.6.2.1 加酒量考察取“2.1”項下生黃芩飲片,共5份,每份20 g,加入生黃芩飲片質量的5%、10%、15%、20%、25%的黃酒,悶潤30 min后,單層鋪于密閉容器內,置微波爐托盤上,設定微波功率300 W、微波時間3 min,考察不同加酒量對綜合評分的影響。結果,當加酒量為10%時,綜合評分最高,故選擇加酒量5%～15%進行正交試驗,詳見表2。

表2 不同加酒量對綜合評分的影響

2.6.2.2 悶潤時間取“2.1”項下生黃芩飲片,共5份,每份20 g,加入10%黃酒,悶潤10、20、30、40、50 min后,單層鋪于密閉容器內,置微波爐托盤上,設定微波功率300 W、微波時間3 min,考察不同悶潤時間對綜合評分的影響。結果,悶潤30 min時的綜合評分較高,故選擇悶潤時間20～40 min進行正交試驗,詳見表3。

表3 不同悶潤時間對綜合評分的影響

2.6.2.3 微波功率取“2.1”項下生黃芩飲片,共5份,每份20 g,加入10%黃酒,悶潤30 min后,單層鋪于密閉容器內,置微波爐托盤上,分別設定微波功率100、180、300、450、600 W,微波時間3 min,考察不同微波功率對綜合評分的影響。結果,微波功率為180 W時的綜合評分較高,故選擇微波功率100～300 W進行正交試驗設計,詳見表4。

表4 微波功率對綜合評分的影響

2.6.2.4 微波時間取“2.1”項下生黃芩飲片,共5份,每份20 g,加入10%黃酒,悶潤30 min后,單層鋪于密閉容器內,置微波爐托盤上,設定微波功率180 W、分別設定微波時間1、2、3、4、5 min,考察不同微波時間對綜合評分的影響。結果,微波時間為4 min時的綜合評分較高,故選擇微波功率3～5 min進行正交試驗設計,詳見表5。

表5 不同微波時間對綜合評分的影響

2.7 正交試驗在單因素試驗結果為依據,本研究以加酒量(A)、悶潤時間(B)、微波功率(C)、微波時間(D)為考察因素,以黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量的綜合評分為評價指標,采用L9(34)正交表進行設計。酒黃芩微波炮制工藝的因素與水平見表6,試驗設計方案與結果見表7,方差分析結果見表8。

表6 酒黃芩微波炮制工藝的因素與水平

表7 酒黃芩微波炮制工藝L9(34)正交試驗

表8 酒黃芩微波炮制工藝的方差分析

表9 生黃芩飲片與兩種炮制品含量對比(n=3)

由正交試驗結果,各因素對4種黃酮類化學成分的影響大小順序依次為:D>A>B>C,最優組合為A1B2C3D3,由方差分析結果,因素D對綜合評分有顯著影響(P<0.05),因素A、B、C無顯著影響(P>0.05),正交試驗結果顯示當加酒量為5%時,綜合評分較高,但是因為加酒量沒有顯著性差異,參考相關文獻結合單因素試驗結果[17],選擇加酒量為10%。即加酒量10%,悶潤時間為30 min,微波功率為300 W,微波時間5 min為微波炮制酒黃芩的最佳工藝。

2.8 驗證試驗取3批“2.1”項下生黃芩飲片,每批100 g,按上述最優微波炮制工藝制備3批酒黃芩樣品,再按“2.2”項下方法分別測定含量。結果,黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的平均含量分別為15.65%、5.94%、3.00%、0.33%,平均評分98.24,RSD為0.99%,表明該工藝所得微波炮制工藝穩定可行。

2.9 生黃芩飲片與兩種炮制品的含量比較分別取“2.1.1”項下生黃芩飲片20 g,按照“2.1.2”和“2.1.3”項下方法炮制傳統酒黃芩飲片和微波炮制酒黃芩飲片,再按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,“2.3”項下方法分別測定生黃芩飲片及其兩種炮制品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量,每份樣品平行測定3次。采用SPSS 17.0軟件對數據進行單因素方差分析,檢驗水準α=0.05。結果顯示,與黃芩生品相比,黃芩傳統酒制與微波酒制品中4種黃酮類化合物的含量均顯著性升高(P<0.05);與傳統酒制品相比,微波酒制黃芩中4種黃酮類化學成分顯著性增加(P<0.05)。

3 討論

黃芩作為一種常用的中藥材,具有清熱燥濕的功效。然而,由于其苦寒的性質,長期大量使用可能會侵襲人體的正氣。為了緩解這種潛在的副作用,在臨床上常采用黃酒來進行炮制。研究表明,黃酒可以在一定程度上改變黃芩的藥性[18]。黃酒的熱性可以緩和黃芩的苦寒性質,同時其易入血分的特性也有助于增強黃芩的清熱功效[19-22]。黃酒作為溶媒在炮制過程中與黃芩發生相互作用,研究發現黃酒可以改變黃芩的化學成分,并使其總黃酮含量增加,與酒制增效的傳統理論相符[23]。

中藥飲片經炮制后臨床功效的改變基于其所含化學成分的變化,因此,中藥飲片的規范化炮制及其炮制后化學成分的微妙變化成為近些年研究的熱點。以黃芩苷為例,黃芩活性的發揮離不開鄰二酚羥基的存在,然而隨著溫度的升高,其氧化降解速度加快,這是黃芩活性發揮的關鍵物質基礎。此外,隨著炮制時間的增加,黃芩中鄰二酚羥基的含量呈現出先上升后下降的變化趨勢[24],所以,在炮制工藝優化過程中,應避免長時間,較高溫度的加熱。炒制、蒸制、煮制是中藥炮制中經常用的方法,但是長期以來中藥炮制技術由于機理不明,工藝粗糙,而且在炮制過程中還受到諸多主觀因素影響,致使飲片質量很難控制[25]。與傳統炮制方法比較,現代微波炮制有操作簡便、工藝參數容易控制、效率高、產品質量均勻和溶出度好等優點[26]。

本試驗將層次分析法與判斷矩陣相結合,針對關鍵影響因素黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素分別給予相應的權重系數,因為黃芩苷是藥典中規定的主要檢測成分,并且是黃芩中發揮藥效的主要活性成分,所以給予黃芩苷0.6的權重系數[14,27-28],同樣為苷類成分的漢黃芩苷給予0.2的權重系數[29-30],而黃芩素和漢黃芩素含量較少,且其含量與溫度關系密切,所以,分別給予0.1的權重系數[23]。并與加權評分相結合,得出了微波加工酒黃芩的最佳工藝條件,從而更加合理和可信。通過方法學的驗證表明本方法具有重復性和專屬性,且穩定性較好。但是因為微波炮制工藝作為一種新的炮制工藝是否能完全取代傳統炮制方法還需要后續藥理藥效試驗、毒理實驗、化學成分分析和臨床研究來進一步證實。