藏藥三果湯治療糖尿病作用機制的網絡藥理學與分子對接技術分析

郭爽,劉海鵬,申雋于,李蓉,夏宗霄,龍小妹,范源,

(1.云南中醫藥大學中藥學院,云南 昆明 650500;2.云南中醫藥大學第二附屬醫院,云南 昆明 650216;3.南京中醫藥大學,江蘇 南京 210023)

糖尿病(diabetic mellitus,DM)是一種以高血糖為特征的代謝性疾病,高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損,或兩者兼有引起的。糖尿病臨床常見類型為1型糖尿病和2型糖尿病,1型糖尿病是由于胰島β細胞損傷導致胰島素缺乏所致;2型糖尿病是胰島素抵抗拌胰島素缺乏所致[1]。長期高血糖會導致其他組織,包括眼、腎、心臟、血管的慢性損害、功能障礙等。流行病學顯示,印度和中國的糖尿病患病率占全球糖尿病患病的40%。目前糖尿病的治療主要以胰島素注射[2]和二甲雙胍等藥物為主[3],但胰島素在印度部分地區無法獲得,在治療過程中經濟問題成為影響治療的主要原因之一[4]。

在傳統藏醫學中,糖尿病被認為是“京尼薩庫”病范疇,藏醫理論認為“京尼薩庫”主要是由于飲食起居不當等因素導致“三因”失衡引起,所謂“三因”指的是隆、赤巴、培根,即中醫中的氣、膽、痰。藏藥三果湯,由訶子、毛訶子、余甘子三味藥構成,其方名由印度“三果”經古絲路傳播演變而成[5],具有清熱、調和氣血以及分離精濁等功效[6]。在大鼠體內實驗研究表明,三果湯能降低空腹血糖水平[7],并能抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶活性[8]。體外細胞實驗結果表明三果湯通過增強incretin/cAMP信號通路活性,影響胰島β細胞增殖和凋亡[9]。在糖尿病并發癥的治療中,三果湯通過抑制TGF-β1和氧化應激,改善糖尿病腎病癥狀[10];改善TGF-β1、TNF-α、IL-1β,降低糖尿病神經病變進展。相關研究表明,癌癥通路為三果湯主要通路之一,Ali Sahragard團隊研究發現,三果湯提取物可抑制人肝癌細胞增殖,降低其存活率[11]。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論,對生物系統的網絡分析,選取特定信號節點進行多靶點藥物分子設計的一門學科。強調對信號通路的多途徑調節,是提高藥物的治療效果,降低毒副作用,提高新藥臨床試驗成功率的有力手段。最早由我國學者李梢提出“網絡靶標”,并制定首個標準《網絡藥理學評價方法指南》,為網絡藥理學這一新興學科奠定了基礎[12-13]。網絡藥理學能夠通過對中藥復方作用靶點及信號通路的分析,預測潛在的藥理作用及信號通路,對中藥復方的基礎研究及臨床應用提供了新思路[14]。本研究就藏藥三果湯治療糖尿病作用機制進行網絡藥理學分析及分子對接驗證進行初步探討,為后續實驗提供思路。

1 實驗方法

1.1 網絡藥理學

1.1.1 三果湯的活性成分及作用靶點采用TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php),分別檢索三果湯中訶子、余甘子、毛訶子有效成分,并根據藥物口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18進行初步篩選,由于TCMSP中檢索毛訶子結果為無,則結合前期研究及文獻,以及在PubChem數據庫(http:pubchem.gov)檢索結果整合毛訶子中化合物。使用UniPort數據庫(http:www.uniprot.org uniprot )將化合物靶點蛋白名稱轉換為基因名,刪去重復項,即得三果湯潛在作用靶點。

1.1.2 糖尿病相關靶點篩選以Diabetic為關鍵詞在Genecard數據庫(https://www.genecards.org)、DRUGBANK數據庫(https://www.drugbank.ca/)進行檢索,結合文獻查閱結果,進行結果整合,刪除重復項,使用UniPort數據庫(http://www.uniprot.org uniprot )將靶點名轉換為基因名。

1.1.3 構建藥物靶點疾病靶點PPI網絡及富集分析蛋白質相互作用網絡(PPI)是指蛋白通過彼此之間的相互作用構成,來參與生物信息傳遞、基因表達調節、能量和物質代謝及細胞周期調控等生命過程的各個環節,系統地分析了蛋白在生物系統中的相互作用關系。

使用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)在線制作疾病靶點、藥物靶點的VENN圖,導出三果湯和糖尿病的共同靶點。使用STRING(https://string-db.org)數據庫,將物種選為Homo Sapiens,設置靶點關聯置信度為0.900,隱藏無蛋白相互作用靶點,獲得PPI網絡圖。使用Cytoscape v3.9.1構建“藥物-成分-靶點-疾病”關系網絡。

采用Matescape數據庫(https://metascape.org)進行GO富集分析和KEGG通路分析,物種選擇“H specises”,選擇“Custom Analysis”,分別進行KEGG通路分析和GO富集分析。 其中,GO富集分析包括細胞組分(CC)分析、分子功能(MF)分析和生物過程(BP)分析,通過富集分析可以看到目標基因在3個層面上的關聯。篩選4次分析的數據前20個通路,繪制出富集條形圖和氣泡圖。

1.2 分子對接使用PDB數據庫(https://www.rcsb.org)下載蛋白靶點對應的晶體結構,在TCMSP中下載藥物有效成分的3D結構的mol.2格式。使用AUTODock Tools去加氫,計算電荷等,為分子對接提供基礎數據。使用AUTODock 進行分子對接,對接的結果通過Openbabel(Ver3.1.1)將其轉換為pdb格式,用pymol2.6.0進行圖像處理。

2 實驗結果

2.1 三果湯中活性成分篩選通過TCMSP篩選及文獻檢索補充,可得三果湯中有效活性成分共48種,主要為萜類、黃酮類、多元酚類成分,活性靶點以沒食子酸、訶子酸、訶子次酸、鞣花酸、槲皮素等為主(見表1)。

2.2 藥物靶點、疾病靶點韋恩(VENN)分析根據TCMSP、Genecard、DRUGBANK數據庫及文獻篩選出三果湯有效成分對應靶點和糖尿病作用靶點,可知,三果湯成分有效靶點共283個,糖尿病疾病靶點共16 660個,經篩選得出具有作用靶點的有效化學成分35個。使用微生信網站繪制VEEN圖(見圖1),由圖可知,三果湯與糖尿病作用靶點有269個共同靶點。根據VENN分析結果,由于有效成分名稱復雜,故作圖時,給予標號S1～S35命名,并使用Cytoscape 3.9.1繪制藥物-成分-靶點-疾病網絡關系圖(見圖2),節點度高的主要化學成分包括quercetin、ellagic acid、(-)-epigallocatechin-3-gallate等。

圖1 三果湯藥物作用靶點與糖尿病疾病靶點的VENN圖

圖2 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖(橘色為疾病與藥物,藍色為藥物主要化學成分,綠色為藥物與疾病作用靶點)

2.3 三果湯治療糖尿病蛋白相互作用網絡分析使用STRING數據庫對三果湯治療糖尿病蛋白之間相互作用的網絡圖構建,隱藏無蛋白相互作用靶點后,PPI網絡中包含節點274個,節點之間包括1 238個蛋白作用關系以及464個預期作用關系。其中,AKT1、HAS2、MAP2K、CDH1、PRKCG、PLAT等靶點作用最為突出,預測可能作用靶點為:PSMA4、RFC2、PSMC4、TNFRSF1A、KEAP1。

A.GO-細胞組分分析;B.GO-生物過程分析;C.GO-分子功分析

2.4 三果湯治療糖尿病GO功能富集使用Metascape數據庫對進行GO功能富集(見圖3),根據分析出的富集通路,選擇富集的前20個繪制富集柱狀圖,由藍色到紅色-log10依次遞減。GO功能富集分析從3個層面進行分析:細胞組分(CC)分析、分子功能(MF)分析和生物過程(BP)分析。從圖中可知,從細胞組學層面分析,主要富集在膜筏、轉錄調節復合物、膜側等;從分子功能層面分析,主要富集在蛋白質同二聚化活性、蛋白質結構域特異性結合、激酶結合等;從生物過程層面分析,主要富集在對激素的反應、對細胞因子的反應、對無機物的反應等。

2.5 三果湯治療糖尿病KEGG通路富集分析使用Metascape數據庫對進行KEGG通路富集分析(見圖4),根據KEGG通路分析,三果湯治療糖尿病的信號通路主要在癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、化學致癌-受體激活以及在糖尿病并發癥中的產生作用的AGE-RAGE信號通路。

圖4 三果湯治療糖尿病KEGG通路分析氣泡圖

2.6 分子對接結果根據三果湯有效成分篩選,選擇鞣花酸(ellagic acid)、沒食子酸(gallic acid)與KEGG通路分析通路靶點AKT1、HAS2、MAP2進行分子對接,結合能越小,有效成分和靶點結合的親和力越大(見表2)。通過結合能可以看出,鞣花酸對靶點HAS2親和力最好,同時沒食子酸對HAS2的結合能存在一定的親和力。對于靶點AKT1、HAS2、MAP2,鞣花酸的親和力明顯大于沒食子酸。

表2 分子對接評分結果

3 討論

通過TCMSP等數據庫對藏藥三果湯進行有效成分分析及篩選,并對糖尿病疾病靶點進行分析,三果湯與糖尿病的交集蛋白靶點有269個,其中AKT1、HAS2、MAP2、CDH1、PRKCG、PLAT等靶點作用最為突出,并預測PSMA4、RFC2、PSMC4、TNFRSF1A、KEAP1存在可能為作用的新靶點。對三果湯的研究中,作用成分最為突出的鞣花酸和沒食子酸與作用靶點最為突出的AKT1、HAS2、MAP2進行分子對接,鞣花酸對HAS2的結合能為-5.45,存在較好的親和力,且從對接圖中也可看出構象較穩定,說明鞣花酸對糖尿病受體蛋白結合穩定,存在治療作用。結合分析結果可推測,三果湯治療糖尿病在AKT/MAPK通路存在可能作用機制。

流行病學數據顯示,2017年我國老年人20%以上為糖尿病患者,2020年增長至30%以上[15]。隨著糖尿病患病人群逐漸增加,針對其病癥的治療方式逐漸增多,如通過調節機體免疫及炎癥因子的變化,改善糖尿病的胰島素抵抗,從而降低糖尿病的發生發展[16]。在現代醫學中,中藥對糖尿病及糖尿病并發癥存在良好的療效,臨床試驗表明,中醫藥在輔佐糖尿病冠心病的治療中,存在良好的輔助作用,并存在一定的安全性[17];白藜蘆醇[18]、楊梅素[19]等化合物可誘導機體抗氧化應答,在糖尿病并發癥心肌病病程發展過程中起到保護作用,且存在安全性[20];化瘀及通絡中藥在TGF-β1/p38MAPK信號轉導通路中發揮到作用,可改善糖尿病腎病氧化應激,起到保護作用[21-22]。有關藏藥的資料記載,三果湯在糖尿病的治療中有良好的效果,具有降低空腹血糖,影響胰島β細胞凋亡等[23]。藏藥三果湯中主要成分之一余甘子中主要成分沒食子酸可能升高葡萄糖轉運酶載體(GLUT-2)和PPARγ的表達,發揮降血糖的藥理作用[23]。訶子中有效成分訶黎勒酸能夠降低大鼠進食后的血糖水平[24]。本文對藏藥三果湯治療糖尿病作用機制初步探討,以為相關實驗研究提供參考依據。

綜上所述,三果湯具有多成分、多靶點的作用特點,對糖尿病有明顯的治療效果,本研究為后續三果湯治療糖尿病的相關機制研究提供新思路。在本研究分析過程中發現,三果湯對癌癥治療存在可能性,為后續癌癥治療研究提供參考。本次實驗結果基于數據庫及文獻進行分析,但由于三果湯治療糖尿病作用機制復雜,具體機制需進一步相關實驗驗證。