呂詠敏，胡曉潔，尹小瑞，張蘇云

南京醫科大學附屬南京醫院婦科，南京 210006

環境內分泌干擾物（EDCs）又稱環境激素、內分泌活性化合物、內分泌干擾化合物，是會干擾有機體激素的合成及功能的外源性化學物質。全氟烷基類化合物（PFASs）是EDCs 的的一種，目前廣泛用于各種工業、農業和商業化學物品中。PFASs 的種類眾多，主要有全氟辛酸酯（PFOA）、全氟壬酸酯（PFNA）、全氟辛烷磺酸酯（PFOS）和全氟己烷磺酸酯（PFHxS）等。PFASs 由碳和氟原子構成，其中的氟原子半衰期較長，導致PFASs降解時間較長，可在自然環境和生物樣品中持久存在。人主要是通過攝入被污染的水、食物和灰塵間接攝入PFASs。目前人血清里可以普遍檢測到PFOA、PFNA、PFOS 及PFHxS 等。PFASs 對人類生殖功能的影響是目前的研究熱點。卵巢作為女性生殖器官，能產生卵子并且分泌類固醇類激素，具有生殖和內分泌功能。女性出生時卵巢內已有足夠數量的始基卵泡，青春期部分卵泡會在性激素的調控下發育為初級卵泡、次級卵泡和竇卵泡等，經過募集卵泡、選擇優勢卵泡后排卵。EDCs可以通過影響卵泡發育、性激素合成影響卵巢的生殖和內分泌功能，導致更年期提前、卵巢早衰和不孕等疾病。國內外已有較多關于PFASs對卵巢毒性作用的相關報道，現從卵子發生、卵泡發育及卵巢類固醇激素合成過程等方面將PFASs對卵巢的毒性作用及其機制進行綜述如下。

1 PFASs對卵巢的毒性作用

PFASs 對卵巢的毒性作用主要表現在延遲月經初潮時間、導致月經周期紊亂、抑制卵巢類固醇激素合成、導致卵巢衰老、多囊卵巢綜合征（PCOS）及子宮內膜異位癥等方面。

1.1 PFASs 可導致月經初潮延遲 女性平均月經初潮年齡一般為13歲左右，若較平均值延長2～2.5年仍無青春期發育體征出現被稱為月經初潮延遲。月經初潮階段的子宮對EDCs 十分敏感，性激素水平決定月經初潮的時間，初潮時間的延遲可能與日后生理疾病的發生、不良妊娠結局的出現以及年老后心血管疾病的增加有關。目前國內外就PFASs水平與月經初潮早晚的相關性研究并沒有得到共識。有研究稱，PFASs 的暴露與月經初潮時間的早晚并無明確的相關性［1］。也有一項通過對2931 例8～18歲女孩進行的橫向研究發現，血清中PFOA 和PFOS的濃度與初潮的年齡有較大的關系，濃度最高的四分位數組與最低四分位數組相比較，PFOA 和PFOS分別造成了初潮時間延遲130、138 天［2］。一個丹麥的出生隊列在2008～2009 年對267 例20 歲左右的女性進行了隨訪，發現與PFOA 濃度較低的參考組相比，體內PFOA 濃度較高的女性其月經初潮年齡會推遲5.3個月，而PFOS 的暴露水平并沒有發現與月經初潮的年齡相關［3］。一項英國隨機對照試驗［1］發現，實驗組為218 例初潮年齡＜11.5 歲的女孩，對照組為230 例初潮年齡≥11.5 歲女孩，結果發現，初潮年齡的早晚與接觸PFOSA、 EtFOSAA、MeFOSAA、 PFOS、PFOA、PFHxS及 PFNA等物質無關。

1.2 PFASs 導致月經周期紊亂 月經周期的主要特征包括其規律性、周期長度和月經量。無論是動物模型還是臨床相關性分析結果均發現，PFASs 暴露會影響正常月經周期的建立。據Lyngs? 等［4］報道，在三個國家（格陵蘭島、波蘭和烏克蘭）的1623例育齡期婦女體內，PFOA 的暴露水平與較長的月經周期（周期長度≥32 天）之間存在統計學上的明顯相關性，而對PFOS 暴露水平的分析中并沒有發現其與月經周期的相關性。另有一項對950 例中國婦女的橫斷面分析顯示，PFOA、PFOS、PFNA 和PFHxS暴露水平的增高與育齡期女性月經周期的紊亂和月經周期的延長有關。PFOA、PFNA 和PFHxS 濃度較高的女性更有可能出現月經量過少的情況［5］。

從丹麥國家出生隊列（DNBC）研究［6］結果發現，在隨機納入1240例孕婦的臨床資料后，發現PFOA、PFOS 與月經不調有關，接觸PFOA 和PFOS 較多的婦女出現月經紊亂的概率會升高。LUM 等［7］使用了來自密歇根州和德克薩斯州的501 對夫婦的數據，這些夫婦在為懷孕而停止避孕時加入了一個前瞻性隊列--生育力和環境縱向調查（LIFE）研究。與PFDA血清濃度最低的三分位數相比，第二個三分位數的女性月經周期延長3%，但PFOA 濃度最高的三分位數女性的月經周期比PFOA 最低的三分位數的女性短2%，PFOS并沒有觀察到與月經周期的相關性。當然，也有研究發現，母親接觸PFOA 和 PFOS 與其月經周期的長短或其后代的卵巢卵泡數量之間并沒有明確的關聯［3］。由于研究設計差異和潛在的地理暴露差異，很難解釋PFASs 水平升高是否會導致月經不調，或者月經不調是否會導致血清PFASs 水平升高，因為月經也是女性PFAS 代謝的關鍵途徑之一。

1.3 PFASs 可抑制卵巢類固醇激素的合成 血清PFOS 水平與女性血清性激素水平相關，PFASs 可能通過上調或下調負責膽固醇轉運和卵巢類固醇生成的蛋白質的表達來干擾卵巢的正常生理功能。ZHANG 等［8］研究發現，PFOS 暴露可能會降低卵巢早衰患者血清中雌二醇及催乳素的水平，同時升高卵泡刺激素的水平。MCCOY 等［9］研究發現，在接受體外受精的女性中，PFOS的濃度與血清雌二醇的水平之間存在負相關。一項納入25 957例成年女性的隊列研究［10］結果發現，PFOS暴露水平與女性血清雌二醇水平降低相關。另有研究［11］結果發現，PFOS暴露導致25～35 歲、健康、正常月經周期的未經產女性血清雌二醇和孕酮水平明顯降低。HEFFERNAN等［12］研究發現，在沒有多囊卵巢綜合征的健康女性中，PFOS的暴露會顯著降低游離雄激素指數FAI。

研究［8-12］認為，PFOA 暴露可能與血清性激素水平變化無關。2011～2012 年全國健康和營養調查的研究［13］結果發現，PFOS、PFOA 暴露與12～80 歲女性的血清睪酮水平無關。另有研究［3］發現，PFOS和PFOA 的子宮內暴露不會影響其后代的血清總睪酮、性激素結合球蛋白、FAI、脫氫表雄酮、雌二醇、卵泡刺激素、黃體生成素及抗苗勒管激素的水平。但也有體外研究［14］報道，低劑量的PFOA 可以通過加速脂肪酸的代謝來刺激睪丸中類固醇激素的生成。

HEFFERNAN 等［12］在多囊卵巢綜合征的病例組和對照組中發現，PFNA 的暴露與雄烯二酮的水平均呈正相關，PFHxS 的暴露和健康女性血清總睪酮水平呈正相關。ZHANG 等［8］發現，PFHxS 暴露會升高原發性卵巢功能不全患者的卵泡刺激素水平，同時降低患者體內的雌二醇水平。也有研究［9，13］認為，PFNA、PFHxS暴露與女性血清性激素水平沒有明顯相關性。與成人相比，青少年對PFASs 的易感性更強。一項針對12～17 歲青少年的研究［15］結果發現，PFOA、PFUnDA 和PFOS 的血清濃度分別與性激素結合球蛋白、卵泡刺激素以及睪酮的血清水平呈負相關，但在年輕成年人中并沒有發現這些相關性。同樣，對于參加C8 健康項目的6～9 歲女孩來說，血清中的睪酮水平也與PFOS 的暴露呈負相關［16］。有關PFASs的暴露與性激素的水平的相關性還需要更多的研究來證實。

1.4 PFASs 可導致卵巢衰老、PCOS 及子宮內膜異位癥 早發性卵巢功能不全（POI） 是一種由多病因引起的女性在40 歲前卵巢功能的減退，臨床表現為閉經或者月經稀發4～6 個月，間隔＞4 周連續兩次FSH＞25 IU/L。POI 會導致不孕、骨質疏松、泌尿生殖器官萎縮、心血管疾病、認知功能減退及抑郁等。直鏈PFOS、支鏈PFOS、直鏈全氟辛烷磺酸和PFNA及其他PFASs 類型都可能與卵巢的提前衰老、自然絕經年齡的提前有關。

我們前期研究［8］共檢測了120 例POI 患者、120與之匹配的健康對照體檢者血清中十種常見PFASs的水平，結果發現，與對照組相比，POI 患者血清中PFOA、PFOS 和PFHxS 的水平顯著增高，且隨著PFOA、PFOS 和PFHxS 暴露水平的增高，POI 的發病率也顯著增高。但本研究并未發現POI發病風險增加與PFDA、PFNA、PFBS、PFDoA、PFUnDA和PFHpA暴露的相關性。另有一項國家級健康和營養調查研究［10］發現，PFOA 和PFOS 的暴露與較早的絕經年齡呈明顯的正相關趨勢。有學者［17］發現，相比于健康體檢者，全子宮切除術后患者體內PFOA、PFOS、PFHxS 和PFNA 水平升高。但也有部分研究結論不一致，DHINGRA 等［18］研究發現，PFOA 暴露水平與自然絕經時間并沒有顯著的關聯。

PCOS 是青春期及育齡期女性常見的內分泌紊亂癥候群，該疾病的病因尚未完全了解，可能和遺傳和環境因素有關。一項對180 例PCOS 的不孕患者和180 例健康對照者的研究［19］顯示，血清中PFDoA的濃度與PCOS 不孕癥發生的風險存在顯著的正相關。而PFBS、PFHpA、PFHxS、PFOA、PFOS、 PFNA、PFDA 以及PFUnDA 與PCOS 的發生并無明顯關聯性。一項2003～2006 年的臨床研究［20］數據顯示，子宮內膜異位癥女性血清PFOA、 PFNA 和PFOS 的平均水平均高于健康女性。目前，只有少數研究［21］表明，PFASs的暴露會增加女性罹患卵巢癌的風險，但該研究未觀察到顯著相關性，且納入病例數量較少。

2 PFASs的卵巢毒性作用機制

PFASs 可能從卵子發生、卵泡發育及卵巢類固醇激素合成過程等方面發揮毒性作用。PFASs可能通過激活過氧化物酶體增殖物受體 （PPAR） 信號通路、中斷卵母細胞和顆粒細胞胞間通訊以及誘導產生氧化應激等途徑干擾卵子的發生，PFOS可通過抑制類固醇生成急性調節蛋白mRNA 表達、抑制KiSS1 轉移抑制因子 （Kiss1） 和 KISS1 受體（Kiss1r） 的表達，影響卵泡發育。PFASs 可通過調控負責膽固醇轉運和卵巢類固醇生成蛋白質的表達，抑制卵巢類固醇激素的合成。

2.1 PFASs 影響卵子發生的機制 卵子發生是指從胚胎發育早期開始，經過胚胎期、出生、直至性成熟才完成的由原始生殖細胞形成到卵原細胞，再由卵原細胞形成成熟卵細胞的過程。PFASs 可以通過影響卵子的發生干擾早期卵泡的生成。其潛在作用機制可能包括激活過氧化物酶體增殖物受體（PPAR） 信號通路、中斷卵母細胞和顆粒細胞胞間通訊以及誘導產生氧化應激等。

PPAR是核激素受體家族，可能參與了PFASs致生殖毒性的過程中。已知的三個PPAR家族成員α、β/δ 和γ 都有在卵巢中表達。PPAR-α 和PPAR-β/δ亞型主要在卵巢的膜和基質細胞中表達，而PPAR-γ亞型在顆粒細胞和黃體中高度表達。PPAR-α 可以通過各種靶基因的反式激活來調節脂質代謝和能量穩態，PFASs可以通過與PPAR-α相互作用從而引發代謝障礙［22］。而PFASs 激活PPAR-γ 后能夠抑制參與卵母細胞減數分裂的基因（如內皮素-1 和一氧化氮合酶）的合成，這意味著它在雌性卵子發生中發揮了作用［23］。

一項研究［24］報告稱，用10 μg/mL 的PFNA 體外處理牛卵母細胞22h 會破壞卵母細胞成熟期間的發育能力。卵母細胞存活率的下降可能是由于PPAR-α 的過表達引起卵巢脂肪代謝紊亂進而引起脂肪堆積所造成的。另一項研究［25］也證實了卵細胞質中過多的脂肪與卵母細胞發育能力受損和卵母細胞存活率降低相關。PFASs 可以結合并激活PPAR受體，干擾卵子的發生，進而影響卵巢的相關功能。

除了對PPAR信號通路的影響外，PFASs還可能干擾卵泡的細胞間通信。卵泡內部是無血管的，顆粒細胞之間以及顆粒細胞和卵母細胞之間的細胞-細胞通信依賴于低分子營養物質、信號分子和廢物通過縫隙連接的雙向轉移。當在體外用含PFOS 的水溶液處理44 小時后，豬卵巢中活卵母細胞的數量和成熟卵母細胞的百分比明顯減少［26］。同樣，體外暴露于PFOS7 天的胎鼠卵母細胞會出現更多的凋亡和壞死［27］。這些結果可能歸因于PFOS 干擾了卵母細胞和顆粒細胞之間的縫隙連接通信所造成的。

PFASs 還可能通過促進活性氧簇（ROS）的產生，增加DNA 損傷以及降低總抗氧化能力從而誘導氧化應激。小鼠每日暴露于PFOA 會抑制卵巢中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，促進ROS 的生成，增加p53 和Bax 蛋白 （在凋亡細胞死亡中很重要）的表達［27］。另一項研究同樣說明，將大鼠暴露于PFOA，會明顯增加ROS 的產生，干擾線粒體呼吸鏈中復合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的活性并導致卵母細胞的凋亡［28］。

2.2 PFASs 影響卵泡發育的機制 研究［29］發現，PFASs可以在卵泡發育的幾個不同階段影響嚙齒動物卵泡的形成和/或功能。暴露于PFOS4 個月的成年雌性小鼠排卵前的卵泡數量會出現明顯減少，閉鎖卵泡數量明顯增加。此外，小鼠血清中雌二醇和孕酮水平出現降低，可能是由于PFOS 降低了類固醇生成急性調節蛋白 （Star） 的 mRNA 水平的表達，PFOS 對 Star 蛋白的這種影響被認為是卵泡成熟和排卵障礙的可能原因。CHEN 等［27］也報告了類似的發現，PFOS 導致妊娠小鼠卵巢中黃體數量明顯減少，并且卵巢中 Star mRNA 水平的表達也出現了降低。

新生雌性大鼠暴露于PFOS 后，其卵巢原始卵泡、生長卵泡和黃體的數量顯著減少［28］。PFOS可能通過抑制KiSS1 、Kiss1r 表達及下丘腦中kisspeptin神經元的活性發揮卵巢的毒性作用。kisspeptin 信號通路參與卵巢周期的調節及人類青春期的啟動。PFOA 、PFOS 可能是通過破壞下丘腦kisspeptin 神經元信號干擾卵泡發育。

妊娠小鼠經過全氟丁烷磺酸鹽 （PFBS）處理后，產下的雌性后代會表現出卵巢功能受損的許多癥狀：卵巢大小和重量降低、卵泡數量減少（所有階段）、陰道開放延遲、發情時間延遲、發情期延長和血清雌二醇水平的降低。此外，PFBS 還會破壞與低甲狀腺素血癥一致的甲狀腺激素的合成，表現為妊娠第20 天及雌性后代中甲狀腺激素三碘甲狀腺原氨酸（T3） 和甲狀腺素（T4） 的血清水平的降低［30］。越來越多的動物和人體研究［31］結果發現，甲狀腺激素的水平會隨著 PFASs 濃度的增加而減少。甲狀腺激素在卵巢卵泡發育和成熟以及其他生理功能的維持中起著不可或缺的作用。甲狀腺激素不足可能通過影響卵泡液抑制素、雌激素和其他細胞因子的產生來影響卵泡的正常發育。

2.3 PFASs 影響卵巢類固醇激素合成的機制 卵巢的另一個主要功能是產生和分泌性類固醇激素。卵巢類固醇激素的生成依賴于卵泡膜細胞和顆粒細胞的協調作用以及下丘腦-垂體-性腺軸的調控。甾體激素的生物合成需要多種羥化酶及芳香化酶的作用，在LH 的刺激下，卵泡膜細胞內的膽固醇經P450膽固醇側鏈裂解酶 （CYP11A1） 的催化轉化為孕烯醇酮。孕烯醇酮在3β 羥基類固醇脫氫酶 （3β-HSD） 的作用下轉化為前體雄激素脫氫表雄酮（DHEA），其中涉及酶 17α 羥化酶、20-脫氨酶（CYP17A1） 或孕酮的產生。然后，孕酮和 DHEA 分別通過 CYP17A1 或 3β-HSD 轉化為雄激素A4。卵泡膜細胞中產生的最終雄激素類固醇是睪酮 T。A4和T 是卵泡膜細胞類固醇生成的雄激素的終產物，可以跨過卵泡基底層遷移到顆粒細胞中。在排卵前的卵泡中，顆粒細胞增殖并分化，產生越來越多的17β-雌二醇。卵泡膜細胞含有LH 受體 （LHRs），LH在與其受體結合后，刺激卵泡膜細胞衍生基因的轉錄，這些基因編碼膽固醇轉化為雄激素所需的酶。顆粒細胞含有FSH 受體 （FSHRs），與FSH 結合后會刺激顆粒細胞衍生基因的轉錄，這些基因編碼雄激素向雌激素轉化所必需的酶。

PFASs 可以通過上調或下調負責膽固醇轉運和卵巢類固醇生成的蛋白質的表達來干擾內分泌系統的調節。攝入全氟十二烷酸（PFDoA）的雌性大鼠，其青春期前卵巢黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體、Star、Cyp11a1 和 Hsd17b3 的 mRNA 表達會顯著下降，導致雌二醇的合成明顯減少［32］。成年雌性大鼠長期暴露于PFOS 可能會通過減少組蛋白的乙酰化水平來抑制Star 的表達從而降低雌二醇的生物合成［33］。游離的豬卵巢顆粒細胞經過PFOS或PFOA 處理后，細胞內LH/FSH 調控的孕酮、雌二醇和雄烯二酮的分泌會受到明顯抑制［33］。鑒于PFASs 的暴露不會改變卵巢中的底物（膽固醇）的供應，Star mRNA 水平的降低可能是膽固醇轉運減少的原因，而膽固醇是卵巢類固醇生成的必要前體。

PFASs 具有一定的弱雌激素活性，并且與其他弱雌激素一樣，在與雌二醇結合后，這些化合物也會產生一定的抗雌激素作用。下丘腦中的GnRH 神經元不表達ER，雌二醇和T 主要通過弓狀核 （ARC）和前腹室周圍核 （AVPV） 中的kisspeptin 神經纖維向GnRH 神經元發送反射信號。雌二醇和T 可以下調ARC 核團但是上調AVPV 核團中kisspeptin 的表達［34］。有研究發現，成年雌性小鼠經過PFOS 處理后，其AVPV 神經元中kisspeptin 的表達受到抑制，小鼠出現動情間期延長和排卵障礙［35］。我們課題組前期研究［36］也發現PFHxS 的慢性染毒可以通過抑制小鼠下丘腦ARC 和AVPV 核團中kisspeptin 的表達，影響性腺軸的功能，抑制LH 脈沖峰的釋放，導致卵泡發育和排卵障礙。另有研究［37］報道了PFOA影響動情周期及排卵功能的可能機制與下丘腦中kisspeptin 神經元活動的改變有關。因此，PFASs 可能通過抑制ER 介導的AVPV 核團中kisspeptin 的表達造成排卵障礙或生育力的下降。

綜上所述，PFASs 作為EDCs 的一種，可能導致月經初潮時間的延遲、月經周期的紊亂、類固醇激素水平的異常、卵巢功能低下、PCOS、子宮內膜異位癥等。PFASs 可能從卵子發生、卵泡發育及卵巢類固醇激素合成過程等方面發揮卵巢毒性作用。PFASs可能通過激活PPAR 信號通路、中斷卵母細胞和顆粒細胞胞間通訊以及誘導產生氧化應激等途徑干擾卵子的發生，PFOS可通過抑制類固醇生成急性調節蛋白mRNA 表達、抑制Kiss1 及Kiss1r 表達，影響卵泡發育。PFASs可通過調控負責膽固醇轉運和卵巢類固醇生成蛋白質的表達，抑制卵巢類固醇激素的合成。PFASs 各亞型之間、PFASs 與其他EDCs 之間是否存在協同卵巢毒性作用，尚需進一步研究探索。