尿液脫落細胞塊切片的制備

杜天海，呂麗霞，楊潔亮，彭恒，陳敏

四川大學華西醫院病理科，成都 610041

尿路上皮癌是臨床上常見的泌尿系統腫瘤之一，近年來發病率呈逐年上升趨勢。尿脫落細胞學檢測聯合熒光原位雜交（FISH）技術是目前臨床篩查尿路上皮癌的重要檢測方法，具有無創、快速和準確等優點。傳統的尿脫落細胞學和FISH 檢測是在尿液細胞涂片直接染色后顯微鏡下進行檢測分析，細胞涂片容易發生涂片厚、細胞堆積或分散、結構不清及細胞量少等情況，增加了臨床醫師的閱片難度，同時還降低了脫落細胞學檢查的陽性率。快速、多量的采集尿液細胞并加以固定，有助于病理細胞學的診斷。為此，我們將36例疑似尿路上皮癌患者的新鮮晨尿樣本制作成尿液脫落細胞塊，觀察尿液脫落細胞塊切片在蘇木素—伊紅染色（HE）、免疫組織化學（IHC）及FISH 檢測中的應用情況，探討尿液脫落細胞塊在常規病理診斷中的應用價值，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 儀器及設備 熒光顯微鏡Leica DMLS、Abbott ThermoBrite 原位雜交儀。細胞塊試劑盒為昆明東環科技公司（內含內徑為8 mm 或4 mm 的專用含基質離心管，細胞固定液和紅細胞裂解液）、抗體為中杉金橋公司GATA3（克隆號：EP368）即用型抗體、探針試劑盒為北京金菩嘉公司（ CSP3/CSP16 和GLP7/GSP17）、DAPI 復染劑（Abbott 公司），胃蛋白酶（Sigma 產品）、NP-40（Sigma 產品）、檸檬酸鈉緩沖液（Abbott 公司）。恒溫水浴鍋、離心機、橡膠水泥、環保透明劑、鹽酸及乙醇為市售產品。

1.2 尿液脫落細胞塊切片制備方法 收集2022 年7—8 月間四川大學華西醫院連續送檢的36 例臨床懷疑尿路上皮癌患者的新鮮晨尿樣本，每例份尿液樣本＞200 mL，離體時間＜3 h。①尿液沉渣收集：取36 份尿液樣本，分裝入50 mL 離心管后，1 500 r/min離心10 min，離心后送檢細胞學和FISH 檢測，收集剩余尿液沉渣。②紅細胞裂解：向尿液沉渣中加入約沉渣5 倍的專用紅細胞裂解工作液，混勻后靜置5 min，1 500 r/min 離心10 min 裂解紅細胞，吸去上清液。③細胞固定：向沉淀的尿脫落細胞中加入5倍于沉渣的專用固定液，用吸管將細胞吹打分散，常溫固定20 min。④加樣：用金屬浴融化專用含基質的離心管，85 ℃加熱15 min，使離心管內基質完全融化。擰開紅色離心管蓋，用吸管將固定后的細胞懸液加入融化后的基質中并充分混勻（內徑8 mm加樣量約1 000 μL 和內徑4 mm 加樣量約400 μL），蓋上離心管蓋后趁熱立即1 500 r/min離心5 min，使細胞富集到一個平面上。⑤凝固基質：離心富集細胞后將離心管放置4 ℃冰箱冷卻10 min，充分凝固基質。⑥取材：擰開紅色離心管蓋，撕掉專用離心管底端的密封膜，用棉簽從離心管蓋處推出凝固后的基質，用刀片切下細胞富集端（底層細胞含有細胞團和大細胞，一般為病變細胞），放入組織包埋盒，進入與組織塊相同的脫水程序。⑦常規石蠟包埋后切片。

1.3 尿液脫落細胞塊切片制備效果觀察 ①HE染色： 尿液脫落細胞塊切片65 ℃烘烤10 min，依次將切片放入二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，自來水沖洗，切片入伊紅染液中染色2 min，再將切片梯度酒精脫水，二甲苯透明，晾干后中性樹膠封片。②IHC：切片脫蠟至水后在3%雙氧水浸泡10 min，純水清洗，檸檬酸緩沖液高壓鍋中煮3 min，純水清洗，PBS 洗2 次，加一抗于4 ℃過夜孵育。次日用PBS 沖洗切片數次，滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗切片數次，滴加DAB 顯色5 min，純水清洗蘇木精復染15 s，純水清洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片。③FISH 染色：切片65 ℃烤片過夜，環保透明劑常規脫蠟，乙醇脫水，純水高壓修復4 min，37 ℃胃蛋白酶工作液消化15 min，0.1 mol/L 鹽酸浸泡切片4 min，梯度乙醇脫水后晾干。滴加適量探針至組織區域后78 ℃變性5 min，37 ℃雜交過夜。次日梯度NP-40液清洗切片，二脒基苯基吲哚（DAPI）染色，熒光顯微鏡采圖備用。在一個視野中，細胞所占的面積超過40%視為細胞量足夠診斷，視為尿液脫落細胞塊切片制備成功。

2 結果

36 例份尿液脫落細胞塊切片HE 染色后顯微鏡下有15例份未觀察到細胞或查見細胞極少，另21例份制備成功，且制備成的尿液脫落細胞塊可4 μm連續切片，切片上細胞集中并單層平鋪。低倍鏡下可見尿液脫落細胞大小正常，結構清楚，切面形狀規則，細胞豐富集中并單層平鋪，背景干凈，核仁清晰，細胞核和胞質對比清晰，其形態學結構與組織學非常相似，易于后續診斷。

21 例份尿液脫落細胞塊切片后IHC 染色后顯微鏡下可見細胞定位準確，顆粒清晰，染色強度適宜，背景干凈，易于后續診斷。21 例份尿液脫落細胞塊切片FISH 熒光顯微鏡下可見細胞單層平鋪，細胞核大小正常，形態輪廓清晰，熒光紅綠信號清晰，背景干凈，易于后續診斷。

3 討論

尿路上皮癌是常見的泌尿系統腫瘤，近年來發病率逐年上升［1］。尿脫落細胞學涂片檢查作為尿路上皮癌的常規檢測，具有方法簡便，特異性較高，對患者無損傷等特點，已在各層級醫院被廣泛應用。但常規涂片法對技術要求較高，制作的涂片往往要么細胞少而分散，要么細胞重疊堆積，觀察費時，導致敏感度下降出現漏診的情況，同時細胞學涂片還具有難還原組織學結構、不可重復切片和較難進行細胞染色等缺點，不適用于大規模的IHC 染色和FISH 檢測。細胞塊制備技術可將尿脫落細胞離心后經石蠟包埋制成切片，可較清晰顯示細胞內部的細微結構，能提高病理診斷的準確性，有研究顯示直接涂片相比，細胞塊聯合常規涂片可使惡性腫瘤的檢出率增加6.5%～9.0%［2-4］。細胞蠟塊還可以連續切片，同常規石蠟包埋組織一樣可運用于免疫組化和分子檢測，為病理檢測提供額外的診斷信息。

細胞塊制備技術是一種將細胞學樣本壓制成小球并包埋在石蠟塊中以進一步加工成組織學標本的技術，常用的方法有直接離心法，血漿凝血酶法和瓊脂法等［5］。細胞塊制備技術已在多種標本上常規進行，例如胸腹水、細針穿刺等。尿液樣本因不具備網絡脫落細胞的纖維蛋白，在丟棄上清液后剩余的細胞沉淀很難從離心管底部提取，傳統的細胞塊技術往往難以獲得完全滿意的細胞蠟塊。我們制備了一種基于特殊基質制作的細胞蠟塊，該方法使用專用含基質的離心管，基質在加熱到85 ℃后可轉化成液態，混入尿液混懸液后，液態基質中的大細胞、高核漿比細胞在離心力的作用下首先分離沉降至最下層，這些細胞往往是病變細胞；在4 ℃中基質又轉化為固態作為支架材料，將沉淀的細胞固定在特定的空間位置，再將該區域固態基質切割下來的就形成目標細胞塊。該方法操作簡單，易于掌握，在一定程度上使細胞塊的制作標準化。試劑盒配備兩種規格離心管（直徑4 和8 mm），可以根據尿液沉渣的體積選擇合適的離心管，沉渣多的時候選擇直徑8 mm的大容量離心管，細胞量少的時候可選擇直徑4 mm的小離心管。

使用該技術制作的尿液細胞塊與常規組織細胞塊類似，可連續重復制片，且與常規組織蠟塊一樣因隔絕空氣可長期保存。含有特殊基質的細胞塊經常規組織脫水、透明、浸蠟、包埋切片后HE 染色，鏡下顯示細胞單層薄片狀排列、分布均勻、形態完整、結構清晰、染色強度適宜、背景干凈，胞質對比清晰，相較于細胞涂片更容易判讀。IHC 檢測是一種常用的分子生物學技術，通過使用特定的抗體與組織或細胞中的目標分子相互作用，從而實現對目標分子的定位和定量測定。尿液細胞涂片因不具備常規組織結構的缺點而不易進行IHC 染色定位，而尿液細胞塊富集的細胞類似于組織學結構，可以進行IHC 染色。本研究顯示尿液細胞塊IHC 染色效果較好，染色定位準確，背景干凈，對細胞特別是腫瘤細胞的識別更加準確，可以運用于常規病理檢測。尿脫落細胞FISH 檢測可以檢測膀胱癌細胞中3號、7號、17號染色體非整倍性和9 號染色體上P16 基因位點缺失，對尿路上皮癌的早期診斷及復發監測具有重要價值，但傳統的尿脫落細胞FISH 檢測在尿涂片上檢測，常出現細胞重疊或分散的情況，增加了FISH檢測的診斷難度。尿液細胞塊FISH 切片鏡下細胞富集，單層平鋪，DAPI 復染示細胞核形態輪廓清晰，熒光紅綠信號清晰，背景干凈，相對于涂片FISH 染色片，細胞塊切片FISH 染色更易進行熒光顯微鏡下觀察分析，不但降低了閱片難度，還縮短了閱片時間。本研究對細胞量較多的21 例尿液細胞塊均進行了FISH 檢測，其檢測結果均與細胞涂片FISH 結果一致，說明尿液細胞塊FISH 檢測的特異性較高。

雖然尿液細胞塊可能是一種與組織學塊相似的重要資源，但該技術并不適合所有尿脫落細胞樣本。本研究顯示在連續送檢的36例尿液標本中，制成石蠟塊切片后仍有15例僅查見到極少量細胞，經閱片后確認不能滿足診斷要求，這一比例率高達41.67%，這些尿液的狀態描述往往為黃色清亮液體，離心后沉淀體積往往小于0.05 mL，因此，對細胞量較少的尿液樣本不適用于尿液細胞塊的制作。此外，與傳統涂片細胞學相比，細胞蠟塊制作成本高、制作時間長，我們認為細胞塊技術不能夠成為常規尿脫落細胞檢測的替代品，而是其補充。我們的建議是，在篩查尿細胞學樣本時應相當有目的地制作細胞蠟塊，需結合診斷實際需求和尿液細胞沉淀情況，使患者從細胞塊制備中受益最大化。

綜上所述，我們成功制備了尿脫落細胞塊，且制備的尿脫落細胞塊用于HE、IHC 和FISH 檢測效果較好。尿液細胞塊是較易獲得的組織來源，可能成為惡性腫瘤患者組織學分型和基因檢測的有效途徑。但本研究納入樣本量較少，今后應擴大樣本量和檢測范圍進行更深入的研究。