牛膝治療糖尿病周圍神經病變的作用機制

童雅琴 肖文惠 牟彥竹 張迎慶

［收稿日期］20211021

［第一作者］童雅琴（1998-），女，湖北宜昌人，湖北工業大學碩士研究生，研究方向為藥劑學

［通信作者］張迎慶（1969-），女，湖北蘄春人，藥學博士，湖北工業大學教授，研究方向為天然藥物

［文章編號］1003-4684（2023）02-0044-05

［摘要］為探討中藥牛膝治療糖尿病周圍神經病變的機制，分別采用網絡藥理學及分子對接，對牛膝治療糖尿病周圍神經病變的活性成分進行預測。研究結果表明：網絡藥理學分析，篩選得到牛膝對糖尿病周圍神經病變治療有效成分11種，關鍵靶點主要為AKT1 、IL-6、CASP3和 VEGFA。功能富集分析結果表明，牛膝可能通過協同調節HIF-1、MAPK、Fox0等多種生物途徑來治療糖尿病周圍神經病變。分子對接結果表明，紅厚殼內酯是一種具有良好分子對接性能的先導化合物。本研究闡明了牛膝治療糖尿病周圍神經病變的活性成分和作用機制，為尋找治療糖尿病周圍神經病變的先導化合物和新藥研發提供了理論依據。

［關鍵詞］牛膝； 糖尿病周圍神經病變； 網絡藥理學； 分子對接

［中圖分類號］R285? ［文獻標識碼］A

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）屬于糖尿病的常見慢性并發癥之一，致殘率高，對患者的睡眠、情緒等產生負面影響，導致其生活質量下降。研究表明，糖尿病病程越長，DPN的發病率越高，會給整個衛生保健系統和整個社會帶來沉重的經濟負擔[1]。

DPN主要分為周圍神經病變和自主神經病變。DPN臨床患者多有雙側對稱性麻木的癥狀，疼痛表現為刺痛、灼痛，多于夜間加重，同時伴有四肢發涼和麻木感。若傷及運動神經，患者還會出現不同程度的肌力減退，肌腱反射消失等情況。自主神經病變患者會影響心臟功能、胃腸道功能和泌尿生殖系統功能等方面的生理活動[2]。DPN的發病機制比較復雜，即使該病在臨床上很常見，但其具體發病機制到目前為止仍不明確，大部分研究人員認為DPN與神經營養因子缺乏密切相關[3]。最近有學者提出DPN的發病機制可能與感覺神經元及信使核糖核酸（mRNA）的變化有關[4]。

目前，國外治療DPN開始專注于改善患者能量代謝的過程，包括提高患者氧化應激反應能力等[5]。中醫藥防治DPN具有明顯優勢，且安全性高，已成為臨床、科研和新藥研發熱點[6]。中醫藥治療DPN的方法包括中藥湯劑治療、中藥注射液、針灸療法、中醫外治療法等，可有效緩解DPN患者的臨床癥狀[7]。近年來，中藥在治療DPN上臨床療效較好，也越來越受到關注[8]。

中國藥典收載牛膝為莧科植物牛膝（Achyranthes Bidentata Blume）的干燥根。牛膝具有活血祛淤、補肝腎、引血下行的功效，臨床用于淤血阻滯的月經不調、下肢無力等癥，對心血管系統、免疫系統、血液系統和神經內分泌系統等都有一定的作用[9]。牛膝在臨床上可與黃芪、白術等配伍用于治療DPN[10]。研究表明，牛膝提取物具有明顯的降血糖作用，可在一定程度上降低Ⅱ型糖尿病大鼠胰島素抵抗程度，提高其抗氧化能力，改善糖代謝[11]。

本研究目的在于通過中藥網絡藥理學和分子對接的方法，探究牛膝對DPN的作用機制，并且結合文獻，對所得到的化學成分、關鍵靶點、信號通路等信息進行分析，為以后深入研究提供理論基礎。

1??? 實驗材料及方法

1.1??? 化學成分篩選及化學成分潛在靶點收集

本研究采用TCMSP數據庫（https：∥tcmspw.com/tcmsp.php）檢索牛膝相關的潛在靶點。以口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）為篩選指標評價所選出來的化合物，DL值越高，通常表示成分越可能成為藥物。過濾條件為生物利用度大于30%，同時類藥性大于0.18的化學成分。

1.2??? DPN疾病靶點的篩選

利用 GeneCards （ https：∥www.genecards.org/）數據庫，檢索DPN疾病相關基因。GeneCards是人類基因的綜合數據庫，可以提供所有已知和預測的人類基因。

1.3??? 蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

利用R軟件，繪制牛膝與疾病靶點的維恩圖，得到相關表格數據，利用網絡圖像化軟件Cytoscape3.7.2構建藥物調控網絡，利用String軟件進行PPI網絡的構建及分析。

1.4??? GO和KEGG富集分析

為了進一步了解上述篩選出的靶標蛋白基因的功能，以及在信號通路中的作用，將篩選得到的靶點，進行GO（Gene Ontology）生物學過程富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號通路富集分析。為了使結果具有統計學意義，入選條件為P<0.05，以GO（BP）結果前20位與KEGG結果前20位進行展示。

1.5??? 成分靶點分子對接

在以上結果基礎上，選擇PPI網絡中“degree”最大的靶點作為受體，將潛在靶點蛋白名稱輸入UniProtKB數據庫（https：∥www.uniprot.org/）和PDB數據庫（https：∥www1.rcsb.org/），找到相應蛋白的結構，并且利用PyMol軟件進行去水和去除殘基處理。在TCMSP數據庫（https：∥tcmspw.com/tcmsp.php）和Pubchem （https：∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 檢索篩選所有對應靶點的化合物2D結構。利用PyMol軟件和ChemBio3D軟件將所得分子結構進行修飾處理。利用AutoDockvina進行蛋白分子加氫處理，找到相應的活性口袋，然后依次進行分子對接，得到分子對接得分數據。

2??? 實驗結果分析

2.1??? 牛膝主要活性成分篩選

通過分析平臺檢索到牛膝中化合物成分，根據參考條件篩選出成分17個，包括：槲皮素、山柰酚等黃酮類成分；黃連堿、表小檗堿等生物堿類成分；菠甾醇、菠甾醇、B-谷甾醇和豆甾醇等甾醇類成分；蛻皮甾酮等甾酮類成分（表1）。

2.2??? 牛膝活性成分DPN靶點交集圖

牛膝治療DPN潛在作用靶點的預測研究共篩選到牛膝有效成分作用靶點183個，DPN疾病靶點1522個。藥物與疾病靶點的交集圖見圖1。由圖1a可見，兩者交集靶點共92個。由圖1b可見，在該網絡中，共包含節點105個，其中牛膝（drug）、DPN節點各1個，牛膝有效成分節點11個（表1內17個牛膝有效成分中，有6個成分無對應的DPN靶點）分別是槲皮素、山柰醇、漢黃芩素、黃連素、黃連堿、黃芩素、表小檗堿、β-谷甾醇、海棠果素E、豆甾醇和大黃藤素。對應靶點較多的成分為槲皮素，對應83個靶點，提示牛膝中治療DPN的關鍵成分可能為槲皮素。其次為山柰醇和漢黃芩素。與這些成分相連接的靶點數目比較靠前，在牛膝治療DPN的過程中，這些成分比較重要。牛膝治療DPN潛在作用靶點共 92 個。

圖 1??? 牛膝活性成分治療DPN潛在靶點網絡

2.3??? 關鍵作用靶點的PPI網絡分析

牛膝治療DPN 的PPI網絡見圖2，由圖2a可見，該網絡中共有節點數為92，邊數為1616，平均節點度為35.1，平均局部聚類系數為0.688。牛膝治療DPN的關鍵靶點見圖2b，可見節點度值較高的靶點蛋白包括AKT1、IL6、VEGFA、CASP3和JUN等，它們可能在牛膝治療DPN中發揮關鍵作用。

2.4??? GO富集分析結果及KEGG富集結果分析

將功能相似的基因進行富集整理，將P值從大到小排列。圖3中，橫軸代表基因的數目，顏色代表不同功能之間的顯著性差異。通過GO共富集到BP141個條目，將生物學功能較前的20個條目進行排名，結果如圖4所示。其中，細胞因子結合活性共14個靶點，細胞因子活性有 12 個靶點，磷酸酶結合靶點為11個，還有核受體的活性和轉錄因子活性等。通過KEGG富集到了多個信號通路，牛膝治療DPN主要集中在HIF-1、MAPK信號通路、Fox0信號通路、內分泌抵抗、NF-κB信號通路，表明牛膝治療DPN的過程是多通路協調的過程。這些通路可以作為后期牛膝治療DPN的研究方向，其中MAPK信號通路與DPN相關靶點數目最多。

2.5??? 分子對接結果分析

結合前期的分子對接研究基礎，選取靶點疾病關鍵靶點AKT1（PDBID：3o96），分別與11個化合物進行分子對接，對接結果如表2所示。可以看出，雖然槲皮素（Quercetin）是靶點最多的化合物，但其與AKT1的結合能力不如紅厚殼內酯（Inophyllum E）穩定。雖然目前對紅厚殼內酯的研究較為局限，但其是一種具有良好分子對接性能的先導化合物。選擇最優的對接結果進行可視化作圖（圖5）。圖5中綠色的是晶體結構里面的原有配體，藍色部分是化合物分子，可以看出二者結合位置相近，紅色標注出來的是有關鍵作用的殘基，說明紅厚殼內酯（Inophyllum E）通過與AKT1的ASP-292、LYS-268、SER-205 殘基進行對接。

圖5中虛化部分是蛋白晶體結構，紅色標注出來的是有關鍵作用的殘基，綠色的是晶體結構里面的原有配體，藍色的是紅厚殼內酯（Inophyllum E）化合物分子。

3??? 討論與結論

牛膝屬于活血化瘀類藥物，在治療DPN中起著重要的作用[12]。實驗結果共篩選得到了11個活性成分，其中已經有文獻證實的能夠治療DPN且有實驗研究的成分有槲皮素、黃連素、黃芩素[13-14]；少量文獻表示黃連堿、表小檗堿、β-谷甾醇等有一定的降糖作用，但未研究其與DPN的關系[15]；漢黃芩素，紅厚殼內酯，山柰醇，豆甾醇，大黃藤素與糖尿病及其并發癥的研究暫無報道。結果提示，槲皮素為牛膝治療DPN過程中靶點最多的成分，其次是山柰醇和漢黃芩素，這些成分在牛膝治療DPN的過程中可能有主導作用。

在治療DPN的過程中，起著重要作用的靶點為AKT1、IL-6、VEGFA和CASP3。通過文獻查閱，本研究所得的牛膝治療DPN的相關重要靶點和治療機制已得到部分驗證。其中AKT1是AKT激酶的3種緊密相關蛋白激酶之一[16]，研究顯示與AKT1相關的牛膝成分有槲皮素和β-谷甾醇等。IL-6即白細胞間介素-6，在免疫細胞的成熟、活化、增殖和免疫調節等一系列過程中均發揮重要作用[17]，研究顯示調節IL-6相關的牛膝成分為槲皮素和漢黃芩素等。臨床上治療DPN的藥物依帕司他，可明顯改善患者臨床癥狀，降低血清IL-6[18]，槲皮素、漢黃芩素與依帕司他作用靶點相同。CASP3是一種與細胞凋亡信號通路有關的重要的酶。細胞凋亡受到細胞內凋亡調節蛋白的調控，Caspase家族是細胞凋亡過程中發揮關鍵作用的一組半胱氨酸蛋白酶，而其中的CASP3在凋亡級聯反應中是最為關鍵的凋亡蛋白酶[19]。本研究中與CASP3相關牛膝成分有槲皮素和山柰酚等，其中槲皮素可能會激活CASP3信號通路促進細胞的凋亡，通過抑制CASP3的活性，可以減少高糖誘導的細胞凋亡，控制血糖平穩。

牛膝治療DPN主要集中在HIF-1信號通路、MAPK信號通路和Fox0信號通路等。與免疫炎癥系統HIF-1信號通路相關的靶點基因包括AKT1、BCL2、IL-6、NOS2、RELA、VEGFA等。HIF-1信號通路是KEGG富集的所有通路中顯著性最高的通路，HIF-1信號通路在調節血管的生成、葡萄糖代謝及細胞的凋亡和自噬方面具有重要作用[20]。MAPK信號通路與糖尿病的異常代謝有關。與該通路相關的靶點在本實驗中有24個，包括MAPK14、RELA、AKT1、JUN等，與牛膝中多個成分相關。已有文獻報道證實，槲皮素可以增加 MAPK 的表達水平和促進 MAPK磷酸化來上調葡萄糖轉運載體的表達，促進糖的吸收和利用，增加胰島素受體的敏感性，改善胰島素抵抗[21]? 。FoxO信號通路是胰島素轉導中一個關鍵信號通路，FoxO是Forkhead box（ Fox）大家族中的0亞族，在代謝紊亂、人類壽命和腫瘤抑制中發揮重要作用。Fox0蛋白因子是胰島素信號通路的最終效應因子，通常通過誘導肝臟中的糖異生、抑制脂肪細胞和心肌細胞分化，或將肌肉中的燃料利用從葡萄糖轉移到脂質來應對營養物質的減少[22]。因此，Fox0蛋白的失調與胰島素抵抗、飲食肥胖和2型糖尿病的發病機制有關。根據實驗結果推測牛膝可以通過調控AKT1、IL-6等靶點來上調FoxO表達量，起到對β細胞氧化應激的保護作用[23]。

有效預防和控制糖尿病及其并發癥疾病發生，一直是國內外生物醫學科學領域的國家需求。本研究通過網絡藥理學、分子對接探討了牛膝在治療DPN的過程中的作用機制，發現牛膝中的槲皮素、漢黃芩素、紅厚殼內酯等活性成分值得進一步深入研究，為臨床上牛膝治療DPN及相關藥物研發提供了新的理論依據。

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The Mechanisms of Achyranthes Bidentata Blume inTreating Diabetic Peripheral Neuropathy

TONG Yaqin， XIAO Wenhui， MU Yanzhu， ZHANG Yingqing

（School of Biological Engineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China）

Abstract：To systematically investigate the mechanisms of Achyranthes Bidentata Blume in treating diabetic peripheral neuropathy.Methods： In this study， network pharmacology， molecular docking analysis were used to predict the active components of Achyranthes Bidentata Blume in the treatment of DPN.Results： The network analysis showed that there were 17 active components of Achyranthes Bidentata Blume in treating DPN. And the key targets were AKT1 IL 6， CAPSP3 and VEGFA. The functional enrichment analysis indicated that? Achyranthes Bidentata? Blume may treat DPN by synergistically regulating many biological pathways， such as HIF 1， MAPK and Fox0 signaling pathway， etc. In addition， the results of molecular docking showed that Inophyllum E might be a promising leading compound with good molecular docking performance. Conclusions： The active components and mechanism of action of diabetic peripheral neuropathy were fully elucidated in this study， and laid a foundation for finding lead compounds of DPN and developing new drugs for the treatment of DPN.

Keywords：Achyranthes Bidentata Blume；diabetic peripheral neurpthy；network pharmacology; molecular docking

［責任編校： 張眾］