弓形蟲LAMP熒光檢測方法的建立與應用

杜鵑，吳迪，張瑋，程敏姮，李蕊，李剛，陳會玲，王天梓，苗東影，王林*

(1. 北京市動物疫病預防控制中心，北京 102629；2. 北京市大興區農業農村局檢測檢疫和疫病防控中心，北京 102629)

弓形蟲病是由原生動物寄生蟲剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種人畜共患傳染病[1]，可感染所有溫血動物[2]，我國將其列為三類動物疫病[3]。貓科動物是弓形蟲唯一的終末宿主，被感染的貓能夠在感染后的幾天內在糞便中排出數百萬個感染性卵囊[4-5]。人類、嚙齒動物和其他動物作為中間宿主，通過攝入來自環境中的卵囊，即食用受污染的食物、含有弓形蟲的未煮熟的肉或直接接觸貓糞便排出的卵囊而被感染[6-7]。流浪犬在人類弓形蟲病流行病學中的作用也不可被低估，因為它們經常接觸受污染的環境，可以很容易地作為弓形蟲的傳播載體[8]。弓形蟲侵入動物機體后，可經血流輸送至各器官，寄生在這些器官細胞中，并加速分裂增殖，導致組織炎癥、水腫、炎性細胞浸潤、壞死。犬感染弓形蟲后可出現發熱、肌肉麻痹、昏睡及角弓反張等癥狀，貓感染后不會有明顯的臨床癥狀[9]。據統計，世界上30%[10]的人感染弓形蟲，其中，中國有7.88%[11]的人口感染過弓形蟲。目前弓形蟲檢測方法分為病原分離鑒定、聚合酶鏈反應(PCR)與酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等，但病原分離鑒定操作復雜、對實驗室要求高，傳統PCR檢測靈敏度低、易污染，免疫學檢測可能存在假陽性等問題[12]，因此亟需建立一種快速、準確、不易污染、儀器設備適配性高的檢測方法。

環介導等溫擴增檢測方法(LAMP)是一種新型的體外等溫擴增核酸檢測技術[13]，該方法針對靶基因的6個特定區域設計4種特異性引物[14]，在鏈置換脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶作用下，可實現在15～60 min，60～65 ℃條件下完成109～1010倍的擴增反應[15]，是一種快速、無污染、準確的新型核酸擴增方法。本研究建立了一種基于SYTO9熒光染料的弓形蟲LAMP熒光檢測方法，可通過熒光曲線判讀結果，無需開蓋電泳，具有靈敏度高、特異性強、儀器設備適配范圍廣等優點，適合現場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種及試劑

LoopampDNA 擴增試劑盒購自榮研生物科技(中國)有限公司，弓形蟲實時熒光定量PCR檢測試劑盒(批號：TOX20220809P)購自哈爾濱元亨生物藥業有限公司。弓形蟲、血吸蟲、貓弓首蛔蟲、犬巴貝斯蟲、犬新孢子蟲、鉤端螺旋體核酸，由北京市動物疫病預防控制中心保存。弓形蟲基因組質粒由中國農業大學饋贈，質粒濃度為450 ng/μL。SYTO9熒光染料購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 儀器設備

便攜式MA-1610型等溫熒光PCR儀購自北京蘭伯瑞生物技術有限責任公司。QuantStudio7熒光定量PCR儀器購自ABI公司，UNOП基因擴增儀購自德國Whutmun，移液器購自德國Eppendorf公司。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank已發表弓形蟲特異基因片段(GenBank：AF146527)，運用PrimerExplorer 在線生物軟件(http：//primerexplorer.jp/)，通過調整GC含量、Tm值、dG臨界值等參數值，設計出2組LAMP熒光檢測的引物組，包括基礎引物(F3、B3、FIP、BIP)和環引物(LB)，引物序列見表1和表2。根據《動物弓形蟲病診斷技術》(NY/T 573—2022)中聚合酶鏈式反應(PCR)提供的引物進行引物序列合成。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物組1序列

表2 引物組2序列

1.4 LAMP反應體系的建立與優化

按照LoopampDNA 擴增試劑盒說明書配制25 μL LAMP反應體系，見表3。

表3 LAMP熒光反應體系

1.4.1 引物組的篩選

將450 ng/μL濃度弓形蟲基因組質粒稀釋為104copies/μL，并以此為模板利用引物組1與引物組2進行LAMP熒光擴增反應，比較兩組引物組熒光曲線、擴增反應時間，篩選出最優引物組。

1.4.2 反應溫度篩選

以104copies/μL濃度弓形蟲基因組質粒為模板，利用MA-1610型等溫熒光PCR儀分別在反應溫度為62、64、66、68 ℃的條件下進行LAMP熒光擴增反應，比較各反應溫度下的擴增反應時間。

1.5 靈敏度試驗

將450 ng/μL弓形蟲基因組質粒稀釋為104copies/μL，定量后將總DNA按1∶10進行倍比稀釋至0.1 copies/μL，并使其最終稀釋拷貝數為104copies/μL～10-1copies/μL，并以ddH2O作為陰性對照，使用MA-1610型等溫熒光PCR儀與熒光定量PCR儀進行LAMP熒光反應，評價建立方法的靈敏度。同時，將建立的LAMP熒光檢測方法靈敏度與中華人民共和國農業行業標準：《動物弓形蟲病診斷技術》(NY/T 573—2022)中規定的PCR檢測方法與某一市售的弓形蟲實時熒光定量PCR檢測試劑盒(Ct值<36并出現特定擴增曲線判定為弓形蟲陽性，無Ct值或無特異性擴增曲線判為陰性)進行比對。

1.6 特異性試驗

以弓形蟲陽性樣品，血吸蟲、貓弓首蛔蟲、犬巴貝斯蟲、犬新孢子蟲、鉤端螺旋體核酸為模板進行LAMP特異性檢測，評價LAMP熒光檢測特異性。

1.7 重復性試驗

分別以濃度為104copies/μL～1 copies/μL的弓形蟲基因組質粒為模板，進行LAMP熒光擴增，每個稀釋度重復4次，根據其Ct值計算變異系數，評價該方法的重復性。

1.8 儀器設備適配性試驗

將104copies/μL弓形蟲基因組質粒，按1∶10倍比稀釋至0.1 copies/μL，分別應用QuantStudio7熒光定量PCR儀與MA-1610型等溫熒光PCR儀進行LAMP熒光擴增反應，開機預熱并檢驗儀器性能后，取配制好體系的PCR反應管，放置在樣品槽相應位置，記錄順序，按表4設置擴增參數，進行LAMP擴增。

表4 儀器LAMP擴增參數

1.9 臨床樣品檢測

用已建立的LAMP熒光檢測方法、市售的實時熒光定量PCR試劑盒及《動物弓形蟲病診斷技術》(NY/T 573—2022)中規定的PCR檢測方法，同時檢測已知背景的200份臨床樣品(其中190份為陰性樣品，10份為陽性樣品)，臨床樣品根據《北京市動物疫病監測與流行病學調查計劃(2021—2025)》采集全市動物醫院、散養戶、流浪場所等犬、貓糞便與全血樣品，比對3種檢測方法的符合率。

2 結果與分析

2.1 引物組合的篩選

設計的弓形蟲引物組1與引物組2 LAMP熒光擴增反應結果見圖1。可以看出，引物組1擴增反應時間為11 min，引物組2擴增反應時間為16 min，因此引物組1優于引物組2。

1. 引物組1擴增反應曲線；2. 引物組2擴增反應曲線；3. 引物組1陰性對照；4. 引物組2陰性對照。

2.2 反應溫度的篩選

不同反應溫度條件下擴增曲線見圖2。可以看出，62 ℃條件下擴增時間為12 min，64 ℃條件下擴增時間為19 min，66 ℃條件下擴增時間為21 min，68 ℃條件下擴增時間為32 min，因此弓形蟲LAMP熒光檢測反應條件最佳溫度為62 ℃。

A. 62 ℃；B. 64 ℃；C. 66 ℃；D. 68 ℃。

2.3 靈敏度試驗

評價確定所建立的LAMP熒光檢測方法的靈敏度，檢測結果如圖3、圖4所示，可檢測到1 copies/μL。PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品在529 bp出現條帶即為陽性，檢測結果如圖5所示，可檢測到100 copies/μL。應用弓形蟲實時熒光定量PCR檢測試劑盒進行擴增反應，判定標準為Ct值<36并出現特定擴增曲線判定為弓形蟲陽性，無Ct值或無特異性擴增曲線判定為陰性，檢測結果如圖6所示，可檢測到10 copies/μL。建立的LAMP熒光檢測方法靈敏度高于標準方法與市售某一實時熒光定量PCR檢測試劑盒。

1～6.不同稀釋濃度質粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7～8. 陰性對照。

1～6. 不同稀釋濃度質粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7～8. 陰性對照。

M. DNA分子量標準(DL2000)；1～6. 質粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7. 陰性對照。

1～6. 質粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7. 陽性對照；8. 陰性對照。

各檢測方法靈敏度比較結果見表5。

表5 弓形蟲各檢測方法靈敏度比較

2.4 特異性試驗

本研究建立的弓形蟲LAMP熒光檢測方法特異性結果見圖7。可以看出，建立的LAMP熒光檢測方法特異性良好，可以特異性檢出弓形蟲，與血吸蟲、貓弓首蛔蟲、犬巴貝斯蟲、犬新孢子蟲、鉤端螺旋體無交叉反應。

1.弓形蟲；2. 血吸蟲；3. 貓弓首蛔蟲；4. 犬巴貝斯蟲；5. 犬新孢子蟲；6. 鉤端螺旋體；7-8. 陰性對照。

2.5 重復性試驗

采用104copies/μL～1 copies/μL的弓形蟲基因組質粒為模板進行實時熒光LAMP擴增，每個稀釋度重復 4 次，結果如表6所示，變異系數均小于5%，說明該方法重復性較好。

表6 ASFV熒光LAMP重復性驗證

2.6 儀器設備適用性試驗

分別使用MA-1610型等溫熒光PCR儀與ABI QuantStudio7熒光定量PCR儀對104copies/μL～0.1 copies/μL質粒進行擴增，檢測結果見表7。在50 min內兩種設備均可檢測到1 copies/μL，表明本研究建立的弓形蟲LAMP熒光檢測方法對兩種型號的PCR檢測設備均可適用，既可應用于實驗室QuantStudio7熒光定量PCR儀，又可應用于現場檢測設備MA-1610型等溫熒光PCR儀，且檢測結果穩定。

表7 儀器設備適用性試驗結果

2.7 LAMP熒光的臨床檢測

用已建立的LAMP熒光檢測方法與市售的弓形蟲實時熒光定量PCR檢測試劑盒、行業標準(NY/T 573—2022)同時檢測已知背景的200份臨床樣品(其中190份為陰性樣品，10份為陽性樣品)，比對3種檢測方法的符合率，結果見表8。可以看出，建立的LAMP熒光檢測方法與實時熒光定量PCR方法、行標方法檢測結果一致，三者符合率為100%。

表8 LAMP熒光、實時熒光定量PCR、普通PCR檢測結果

3 討論

傳統的弓形蟲病診斷方法依賴于特異性抗體的血清學檢測，然而這種方法有其局限性[16]，在感染的活躍階段，可能無法檢測到特異性的抗弓形蟲IgG或IgM，因為這些抗體可能直到寄生蟲血癥發生幾周后才能產生[17]。分子法檢測弓形蟲感染具有較高的靈敏度和特異性，具有一定優勢。一些基于PCR的弓形蟲檢測技術已經被開發，然而由于PCR儀器的昂貴成本和反應時間長，這些技術在臨床使用中存在一些局限性[18]。本研究建立的LAMP熒光檢測方法具有靈敏度高、特異性強、儀器適用范圍廣等優點，可以很好地彌補PCR檢測方法的劣勢。

本研究選取弓形蟲基因片段(NCBI GenBank：AF146527)為模板進行引物設計，該基因片段大小為529 bp，在剛地弓形蟲基因組中重復200～300次，是一段高度保守的重復序列，通常被用作弓形蟲PCR診斷。Du等[19]分別利用弓形蟲529 bp重復片段(AF146527)與B1基因(AF179871)為模板進行PCR擴增，結果顯示選取529 bp基因為靶基因擴增弓形蟲靈敏度與特異性均高于B1基因。因此本試驗以弓形蟲529 bp基因為模板進行LAMP引物設計，目的是使建立的LAMP檢測方法更具代表性。與Du等[20]基于弓形蟲529 bp基因片段為模板建立的LAMP檢測方法(檢測限為5 copies/μL弓形蟲速殖子)相比，本研究通過摸索優化LAMP引物建立的熒光LAMP檢測方法靈敏度更優且無需凝膠電泳，具有快速、無污染、靈敏度更高的優勢。

本研究建立的弓形蟲LAMP熒光檢測方法靈敏度為1 copies/μL，高于行業標準規定的靈敏度(100 copies/μL)與市售的實時熒光定量PCR檢測試劑盒的靈敏度(10 copies/μL)。與近年來國內建立的弓形蟲LAMP檢測方法靈敏度比較，朱志偉[20]在2021年建立的弓形蟲LAMP熒光檢測方法的靈敏度為10 copies/μL。王萌[21]建立的弓形蟲LAMP診斷方法采用瓊脂糖凝膠電泳擴增法可檢測到10 copies/μL。因此，本研究建立的檢測方法靈敏度在國內處于領先水平。同時，本研究建立的檢測方法在50 min內即可完成，時間快于某市售實時熒光定量PCR檢測試劑盒(75 min)。

本研究在反應體系中加入SYTO9熒光染料，目的是使儀器設備的適配性更加多樣化，試驗表明，建立的LAMP熒光反應體系既可在專用儀器MA-1610型等溫熒光PCR儀上進行擴增并讀取結果，也可通過設置實驗室熒光定量PCR儀等設備參數進行等溫擴增，且兩種設備均無需開蓋即可判讀結果，大大降低了因瓊脂糖凝膠電泳產生的氣溶膠污染。

總之，本研究建立的弓形蟲LAMP熒光檢測方法在62 ℃ 50 min內對弓形蟲的檢測靈敏度為1 copies/μL，靈敏度高于行業標準(NY-T 573—2022)與某市售的熒光定量PCR檢測試劑盒的靈敏度，與血吸蟲、貓弓首蛔蟲、犬巴貝斯蟲、犬新孢子蟲、鉤端螺旋體均無交叉反應，檢測時間快，儀器適配性高，便于在基層動物醫院及獸醫實驗室推廣應用。