荷葉堿改善高脂飲食誘導比格犬肥胖的試驗研究

盧煒，劉超，盧勁曄，陸江*

(1. 江蘇農牧科技職業學院動物醫學院，江蘇 泰州 225300；2. 江蘇農牧科技職業學院寵物科技學院，江蘇 泰州 225300)

肥胖是一種全球流行的代謝病，可降低人類生活質量，縮短平均壽命[1]。肥胖的特征主要包括皮下脂肪組織和內臟器官中過量的脂肪積累以及高血脂，而且肥胖還可增加許多慢性疾病的風險，特別是2型糖尿病、心血管疾病和肝臟疾病等[2]。目前，我國成年居民的超重和肥胖率超過50%，呈現持續上升趨勢[3]。肥胖的預防和治療已經成為一個重大的公共衛生問題。相似地，肥胖也成為犬最常見的代謝性疾病之一，近年來發病率不斷升高，成為寵物行業關注的熱點問題。然而，現有減肥藥的療效有限，并可能出現嚴重的副作用[4]，預防治療肥胖的新策略仍然是當前領域的研究熱點。

近年來，中草藥由于具有療效確切、毒副作用少等優勢已被廣泛用于肥胖的防治[5]。國家市場監督管理總局規定了50多種藥食同源的中藥可作為具減肥功能保健品的原料藥。荷葉是一種藥食同源的中藥，除了具有清心解暑、活血化瘀、涼血止血、升發清陽、消風祛濕等功效，還具有減肥降脂作用[6]。荷葉堿(nuciferine，NUC)是從荷葉中獲得的一種含芳香環的生物堿，是荷葉發揮減肥降脂作用的主要活性成分[7]。然而，NUC水溶解性小，口服生物利用度低，現有大量研究中常使用助溶劑來提高其生物利用度，相關直接口服NUC的試驗研究較少，不方便NUC相關飲食產品的開發。本試驗以比格犬為動物模型，研究了飼料中直接添加不同劑量NUC對高脂飲食犬的影響，以評估NUC的安全性和抗肥胖效果，從而為NUC的相關抗肥胖產品開發提供試驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

36只比格犬，雄性，3歲，體重10 kg左右購于江蘇泰斯特生物科技有限公司，實驗動物生產許可證SCXK(蘇)2021-0010。

1.2 主要試劑

荷葉堿(純度>98%)，購于Med Chem Express公司。

1.3 試驗設計

36只比格犬以正常飼糧進行適應性飼喂2周后，隨機等分為6組：正常飼糧組(NCD組)、含0.1% NUC正常飼糧組(ND+NUC組)、高脂飼糧組(HFD組)、含0.05% NUC高脂飼糧組(HFD+0.05% NUC組)、0.1% NUC高脂飼糧組(HFD+0.1% NUC組)和0.15% NUC高脂飼糧組(HFD+0.15% NUC組)。然后，各組分別飼喂各自飼糧，試驗期為8周。整個試驗過程中，所有犬均單籠飼養于環境溫度為(25±2)℃、室內濕度為60%左右的動物房中，每天8：30和16：30各飼喂1次，每次進食15 min，自由飲水。正常飼糧參考《犬營養標準》(NRC—2016)配制，各組飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧的組成及營養水平(風干基礎) %

1.4 體重與采食量測定

試驗前與試驗后分別稱量體重。每天觀察記錄采食情況，計算每天采食量，試驗結束時計算平均日采食量。

1.5 皮下脂肪厚度測定

參考郭世洪[8]的方法，在試驗結束時，使用超聲診斷儀(型號：MyLab 9，意大利Esaote公司)，采用7.5 MHZ線陣探頭，對犬腹部臍孔后方進行扇形移動掃描，根據B超影像測量皮下脂肪厚度，連續測量3次取平均值。

1.6 血液樣本采集與指標測定

試驗結束時，空腹采集各組犬的頭靜脈血液，一部分直接放于-80 ℃保存，另一部分在4 ℃下3 000 r·min-1離心15 min得到血清，-80 ℃保存。使用動物血球分析儀(IDEXX Laboratories，Inc.美國)測定血常規，使用動物生化分析儀(IDEXX Laboratories，Inc.美國)測定血液生化指標，使用動物血氣分析儀(南京普朗醫療設備有限公司)測定血中電解質含量，所有檢測均用儀器自帶試劑盒并按操作說明進行。

1.7 皮下脂肪組織HE染色

使用舒泰麻醉后，立即切取腹股溝脂肪組織，置于-80 ℃保存備用。蘇木精-伊紅(HE)染色主要操作如下：將收集的部分腹股溝脂肪組織樣本迅速解凍后用4%多聚甲醛在4 ℃下過夜固定，石蠟包埋，制成4 μm厚切片，然后用HE染色，在顯微鏡(奧林巴斯，日本)下觀察并獲取圖像。用Image J軟件測量脂肪細胞大小，并以每2 000 μm2脂肪細胞面積為間隔點，計算各面積區域內的脂肪細胞比例。

1.8 數據處理

數據以平均數±標準差表示，采用SPSS 23.0軟件單因素方差分析，然后用Tukey檢驗進行差異性分析。P<0.05，表示統計學差異顯著，P<0.01，表示統計學差異極顯著。

2 結果

2.1 荷葉堿對高脂飲食犬體重體脂和采食量的影響

從表2可知，各組間的平均采食量無顯著差異；與NCD組比較，NCD+0.1% NUC組的初始體重、終末體重、體重增量及皮下脂肪厚度均無顯著變化，而HFD組終末體重、體重增量及皮下脂肪厚度均顯著升高(P<0.05)；與HFD組比較，HFD+0.1% NUC組和HFD+0.15% NUC組的終末體重、體重增量及皮下脂肪厚度均顯著降低(P<0.05)，HFD+0.05% NUC組體重增量顯著降低(P<0.05)。

表2 各組間體重、采食量和皮下脂肪厚度的比較

2.2 荷葉堿對高脂飲食犬血球指標的影響

從表3可知，各組間的血常規參數無顯著差異，且均在正常參考范圍內，這表明添加荷葉堿對犬血常規無影響。

表3 各組間血常規參數的比較

2.3 荷葉堿對高脂飲食犬血清生化指標的影響

從表4可知，與NCD組比較，HFD組血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等血脂指標升高(P<0.05)，總膽紅素(TBIL)和堿性磷酸酶(ALT)等指標顯著升高(P<0.05)。與HFD組比較，HFD+0.1% NUC組的TG、LDL-C、TBIL和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平顯著降低(P<0.05)，HFD+0.15% NUC組的TG和LDL-C顯著降低(P<0.05)，HFD+0.05% NUC組的血液生化指標無顯著變化(P>0.05)。

表4 各組間血液生化指標的比較

2.4 荷葉堿對高脂飲食犬血中電解質的影響

從表5可知，各組間的血液中氯、鈉、鉀、鈣和磷等電解質水平無顯著差異。

表5 各組間血液電解質指標的比較 mmol/L

2.5 荷葉堿對高脂飲食犬脂肪組織的影響

各組脂肪細胞大小和分布比較結果見圖1。

腹股溝脂肪組織的HE染色結果顯示，在相同視野內，與NCD組比較，HFD組脂肪細胞數量較少，細胞擴張，添加不同劑量NUC可使脂肪細胞面積變小及數量增加(圖1A)。HFD組脂肪細胞面積分別高于NCD組和NCD+0.1% NUC組，HFD+0.1% NUC組、HFD+0.15% NUC組脂肪細胞面積低于HFD組和NCD+0.05% NUC組(圖1B)。NCD組和NCD+0.1% NUC組中，面積小于2 000 μm2脂肪細胞的比例達80%，HFD組中的脂肪細胞(S>2 000 μm2)的比例約為75%，HFD+0.1% NUC組和HFD+0.15% NUC組中脂肪細胞(S>2 000 μm2)的比例約為40%(圖1C)。

A.脂肪組織HE染色代；B.脂肪細胞大小比較；C.不同面積區間的脂肪細胞分布情況。##P<0.01。

3 討論

肥胖是由于機體長期能量攝入大于消耗，導致過剩的能量以甘油三酯形式堆積與脂肪組織的一種慢性代謝性疾病[9]。飲食結構的改變與肥胖關系密切，高能高脂飲食是肥胖的主要病因[10]。因此，高脂飲食已經成功廣泛應用于各種動物肥胖模型的制備[11-13]。本試驗結果顯示，HFD組比格犬的體重、皮下脂肪厚度及血脂水平均高于NCD組，提示肥胖模型建立成功。而NUC能夠有效改善這些病理癥狀，表明直接補充NUC對肥胖防治具有積極作用。

脂肪組織具有能量維持能力和儲存能力，脂肪組織中脂肪含量的平衡與脂肪形成和脂解這兩個相反的過程有關[14]。在多種因素(如過多能量攝入)引起正能量平衡時，脂肪細胞可通過增加細胞數量(脂肪形成)和細胞內脂質含量(肥大)促進脂肪組織病理性擴增，最終導致肥胖[15-16]。脂肪形成主要受過氧化物酶體增殖激活受體(PPARγ)和CCAAT增強子結合蛋白家族(C/EBP)調節[17]；脂解主要由脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感脂肪酶(HSL)參與的將甘油三酯水解為脂肪酸和甘油，以滿足身體能量需求的一種脂肪代謝途徑，脂解激活可減少脂肪組織中存儲的脂肪含量[18]。因此，一種能夠調節這兩個過程的天然化合物可能會極大改善肥胖患者脂肪組織中的脂肪積累。劉曉琴等[19]研究表明荷葉生物堿能夠抑制前脂肪細胞3T3-L1生長，提示荷葉生物堿能夠抑制脂肪形成。張麗靜等[20]研究表明荷葉堿能夠通過增加脂肪酶活性促進脂解代謝改善C57小鼠高脂血癥。藥動學研究表明，荷葉堿藥物動力學體內過程具有顯著的種屬差異性，在比格犬體內吸收少且代謝快，這可能影響NUC生物利用度和藥效[21]。本研究結果顯示，高脂飲食可引起犬皮下脂肪組織擴張和脂肪細胞肥大，補充0.1% NUC和0.15% NUC均可減輕高脂飲食引起犬脂肪細胞肥大，提示在0.1%和0.15%劑量下NUC的抗肥胖作用不受其藥動學影響。

長期攝入高脂食物容易引起機體內脂質代謝的紊亂，從而引起肝細胞損傷[22]。血中TBIL和ALT是臨床上常用的肝功能生化指標，兩者含量升高往往提示肝功能受損。本研究中，HFD組的TBIL和ALT水平高于NCD組，補充0.1% NUC可降低TBIL和ALT水平，這提示0.1% NUC能夠改善高脂飲食引起的肝酶變化。然而補充0.15% NUC沒有這一作用，其具體原因還需進一步研究。此外，補充NUC對比格犬血球參數和電解質無影響。

對于人類而言，臨床上常用減肥藥物及手術等方法治療肥胖，但是對于肥胖犬貓而言，由于各種因素的限制，獸醫臨床上很少采用減肥藥物或手術減肥。美國曾推出過兩種通過抑制食欲來達到減肥效果的針對寵物犬貓減肥的處方藥，但寵物市場中并未受到廣泛接受，目前已撤出寵物市場。 寵物減肥處方糧經濟實惠，操作方便，效果優良，可能會成為寵物減肥的新方向。本研究發現，在飼料中直接添加荷葉堿可以有效減輕高脂飲食誘導肥胖犬的體重和皮下脂肪堆積，這表明荷葉堿可直接作為功能性飼料添加劑用于防治犬的肥胖癥，綠色安全有效，為寵物犬抗肥胖處方糧的研制提供新思路。

綜上，補充NUC對高脂飲食犬具有抗肥胖作用，無安全問題，其中0.1% NUC效果最佳。