微生物菌劑對秸稈降解及秸稈中微生物變化規律的影響

孫翠煥, 陳麗媛, 陳 杰, 郭玲玲, 敖 靜, 王志學

(遼寧省微生物科學研究院,遼寧 朝陽 122000)

秸稈是一種天然的農業可再生資源和理想的肥料資源[1]。有數據顯示,100 g秸稈中含碳44.2 g、氮0.62 g、磷(五氧化二磷)0.25 g、鉀(氧化鉀)1.44 g,以及鈣、鎂、硫、硅、鐵、鋅、錳、鉬等中、微量元素[2]。我國農作物秸稈每年產量約7億t,其中玉米秸稈占30%左右[3-4],東北地區是我國重要的糧食主產區,每年產生的玉米秸稈總量達1.7億t,秸稈資源十分豐富[5]。秸稈還田是將秸稈直接或間接還田的一種處理方法[6],是一種強化土壤有機質積累、調節土壤溫度和水分的方式[7]。秸稈還田技術的合理利用可緩解土壤質量下降及秸稈資源浪費的情況[8],可以增加土壤有機碳含量,提升土壤肥力[9],同時也是在目前全球變暖條件下,如何利用土壤碳截流減緩溫室效應所追求的目標[10]。秸稈還田對提高氮素有效性有促進作用[11],有研究顯示土壤微生物量碳氮均呈現明顯增加趨勢,表明土壤中的微生態環境得到了很大改善[12]。張旸等[13]研究發現,秸稈還田增加了土壤中碳氮磷鉀的積累量。李辛等[7]研究發現秸稈還田能顯著提高土壤有機質、速效磷、速效鉀的含量,同時還增加了5～15 cm土層的土壤容重,降低了15～25 cm土層的土壤容重。秸稈還田可影響土壤結構,改善土壤微生態[14],增加土壤微生物代謝和多樣性[15]。同時,深層土壤在連續秸稈淺耕還田后,明顯改善了土壤透氣性,并有效降低了土壤容重[16]。秸稈降解所用的腐解菌劑是一類能夠產生纖維素酶、半纖維素酶和木質素酶等的微生物菌劑[17]。由于農作物秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質素組成,自然狀態下難以被微生物分解。添加微生物菌劑可以加快秸稈的腐解,秸稈還田既可充分利用秸稈資源為農田提供大量優質有機肥料,同時可減輕秸稈焚燒造成的生態環境污染,是發展有機可持續農業的有效途徑[18-19]。秸稈原位直接還田是目前我國采用的主要還田方式,該方式存在秸稈腐解較慢、對土壤營養成分提升不明顯等問題[20]。秸稈還田配合使用腐解菌劑可以促進秸稈腐解,使土壤養分增加[21-22]。李祥等[23]采用秸稈+尿素+自制微生物菌劑+土壤調理劑的模式還田,還田10個月,小麥秸稈腐解率達100%,有效改善了土壤結構,并使土壤有機質含量增加。范作偉等[17]在秸稈淺旋和旋耕還田方式下,施用腐解菌劑處理的秸稈腐解率顯著高于未施用菌劑的處理。馮敏等[24]研究表明,秸稈還田能有效增加土壤中氨化細菌、硝化細菌和固氮菌的數量并使其活性增強,進而提高土壤氨化活性和硝化活性,而相關菌群數量的變化與土壤氨化活性和硝化活性呈正相關。楊冬靜等[25]研究發現,水稻秸稈還田可提高土壤中細菌多樣性,小麥秸稈還田可提高土壤真菌多樣性,其他還田方式也對土壤微生物的多樣性有一定程度的影響,說明稻麥秸稈還田改變了土壤微生物群落結構以及微生物菌群的相對豐度。此外,Yu等研究發現,秸稈還田可提高土壤微生物的數量和活性[26],土壤微生物數量和活性的提高對秸稈的腐解又起到促進作用[27],表明秸稈還田與土壤微生物之間是相互促進相互影響的。為明確不同微生物菌劑在秸稈降解中的作用及對秸稈中微生物菌群數量的影響,本研究在溫室大棚內進行不同菌劑對秸稈降解率影響試驗,并研究秸稈中可培養真菌、細菌、放線菌數量的動態變化,以期為微生物菌劑在秸稈還田中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)由遼寧省微生物菌種保藏中心提供。玉米秸稈(喀左天盛農業科技有限公司提供)風干,去除葉片,切段(長10～15 cm),105 ℃烘箱烘干至恒重備用。60目尼龍濾布(購自化試商店)剪成50 cm×50 cm方塊備用。

1.1.2 試驗區 試驗時間為2020年10月至2021年4月,試驗地點為遼寧省喀左天盛農業科技有限公司生產基地溫室大棚。

1.1.3 培養基 ①NA培養基:用于培養細菌;②PDA培養基:用于培養真菌;③改良高氏一號培養基:用于培養放線菌。固體培養基添加2%瓊脂。

1.1.4 主要試劑與儀器設備 生理鹽水(稱取氯化鈉4.5 g,加入蒸餾水500 mL,充分攪拌溶解,121 ℃滅菌20 min,備用)。氯化鈉、牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖等試劑均為分析純。高壓滅菌鍋(LDZX-50KBS,上海申安醫療器械廠);恒溫培養箱(SPX-450,中儀國科(北京)科技有限公司);烘箱(XMTD-8222,上海精宏實驗設備有限公司);電子天平(JA2003,上海天平儀器廠);全溫振蕩器(HZQ-Q,東聯電子技術開發有限公司) 。

1.2 方法

1.2.1 微生物菌劑制備 ①菌種活化:在保藏試管中挑取地衣芽胞桿菌菌體于NA試管培養基上劃線,35 ℃避光培養3 d。挑取哈茨木霉菌絲于PDA試管培養基上劃線,28 ℃避光培養至表面全部變綠。②菌劑制備:挑取活化好的地衣芽胞桿菌至NA液體培養基,35 ℃、180 r/min培養12 h,活菌數約為0.5×108cfu/mL,備用;哈茨木霉試管中加無菌生理鹽水,制成菌懸液,涂布于PDA平板,28 ℃避光培養至表面全部變綠,用無菌生理鹽水將孢子刮下,制成孢子懸液,活菌數調至0.5×108cfu/mL。

1.2.2 試驗設計 試驗設3個處理。對照組:玉米秸稈;處理1:玉米秸稈+哈茨木霉;處理2:玉米秸稈+哈茨木霉+地衣芽胞桿菌。用修枝剪刀將玉米秸稈剪成長10～15 cm秸稈段,用剪好的尼龍濾布包裹秸稈段,每袋100 g,共計27袋。挖9個長50 cm、寬50 cm、深30 cm的土坑。每個處理設3個平行土坑,每個土坑放置3袋秸稈為3個平行樣。秸稈中分別按0.2%(體積分數)的接種量加入無菌水、哈茨木霉、哈茨木霉+地衣芽胞桿菌,覆土厚20 cm并壓實,澆水并保持土壤水潤,每隔30 d,3個處理各取1個土坑的秸稈(3袋同時取出),進行相關指標測定。

1.2.3 秸稈降解率測定 取出各處理秸稈,稱量鮮重,然后用自來水沖洗,去掉泥土及被分解成粉狀的腐殖質,105 ℃烘干至恒重,稱量干重,計算降解率。計算公式:降解率(%)=((100-干重)/100)×100%。

1.2.4 活菌數測定 活菌數采用稀釋平板法測定。①可培養細菌活菌數測定:取出各處理秸稈,稱取濕重5.0 g,用無菌剪刀剪碎(0.5 mm×0.5 mm),置于裝有95.0 mL無菌生理鹽水的帶有玻璃珠的250 mL無菌錐形瓶中,置振蕩器中160 r/min振搖30 min,充分混勻后,取上清液1 mL,加無菌生理鹽水9 mL,制成10倍稀釋液,之后按10倍梯度關系稀釋,分別取10-3、10-4、10-5、10-6稀釋倍液0.1 mL涂平板,平行制備3個平板,30 ℃倒置培養48 h,進行菌落計數。②可培養真菌活菌數測定:樣品處理同①,分別取10-2、 10-3、10-4、10-5稀釋倍液0.1 mL涂平板,平行制備3個平板,28 ℃倒置培養3 d,進行菌落計數。③可培養放線菌活菌數測定:樣品處理同①,分別取10-2、 10-3、10-4、10-5稀釋倍液0.1 mL涂平板,平行制備3個平板,28 ℃倒置培養3 d,進行菌落計數。

2 結果與分析

2.1 不同微生物菌劑處理對秸稈降解率的影響

從圖1可以看出,不同處理對秸稈降解率有很大差異,在降解試驗設置時間內,處理1的秸稈降解率明顯高于對照組和處理2,對照組的秸稈降解率始終高于處理2,表明單獨添加哈茨木霉菌劑處理秸稈,其降解率高于不添加菌劑和添加哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑。添加哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑,其降解率低于不添加任何菌劑的對照組。

圖1 不同微生物菌劑處理對秸稈降解率的影響Fig.1 The effect of different microbial agents on the degradation rate of straw

2.2 不同微生物菌劑處理、不同降解時段對秸稈降解率的影響

從圖2可以看出,處理1與對照組相比,在0～30 d和30～60 d時段,處理1的秸稈降解率明顯高于對照組,從第60天開始,處理1的降解率始終低于對照組,但是總降解率始終是處理1高于對照組;處理2與對照組相比,在0～30 d,處理2的降解率明顯低于對照組,但30～60 d出現一個降解高峰,之后處理2的降解率始終低于對照組,但總降解率對照組高于處理2;處理1與處理2相比,在0～30 d和30～60 d時段,處理1的秸稈降解率明顯高于處理2,之后的降解率沒有明顯規律,相互有高有低,但總降解率始終是處理1高于處理2。

圖2 不同微生物菌劑處理、不同降解時段對秸稈降解率的影響Fig.2 The effect of different microbial agent treatments and different degradation periods on the degradation rate of straw

2.3 不同微生物菌劑處理對秸稈中可培養細菌數量的影響

從圖3可以看出,處理1在0～30 d時可培養細菌數增加迅速,第120天時達到峰值為2.00×109cfu/g,之后緩慢下降;從處理1的整個試驗時段來看,可培養細菌數增加和下降速度較緩慢,在第180天時,可培養細菌數仍為1.02×109cfu/g。

圖3 不同微生物菌劑處理對秸稈中可培養細菌數量的影響Fig.3 The effect of different microbial agent treatments on the quantity of cultivatable bacteria in straw

對照組和處理2可培養細菌數在0～120 d時一直呈上升趨勢,第120天時達到峰值,分別為3.92×109cfu/g和3.10×109cfu/g,可培養細菌數明顯高于處理1,之后迅速下降,在第180天時,可培養細菌數已分別下降至0.58×109cfu/g和0.48×109cfu/g,可培養細菌數均低于處理1。

相關性分析表明,在前30 d,秸稈降解率與可培養細菌數呈正相關,相關系數達到0.935 4。第30天后,秸稈的降解率受其他因素影響較大,與秸稈中細菌數量不相關。

2.4 不同微生物菌劑處理對秸稈中可培養真菌數量的影響

從圖4可以看出,處理1秸稈中可培養真菌數在0～30 d快速增加,在第90天達到峰值為1.9×107cfu/g,之后快速下降;對照組和處理2在0～60 d時,可培養真菌數增加緩慢,之后快速增加,分別在第90天和120天時達到峰值,為1.14×107cfu/g和1.54×107cfu/g,然后緩慢下降。對照組和處理1比處理2的真菌數最高點出現早30 d;處理1和處理2的可培養真菌數在0～120 d均高于對照組。

圖4 不同微生物菌劑處理對秸稈中可培養真菌數量的影響Fig.4 The effect of different microbial agent treatments on the quantity of cultivatable fungi in straw

相關性分析表明,前30 d秸稈降解率與秸稈中可培養真菌數高度相關,相關系數為0.870 5;30～90 d則有很小相關性;第30天后,秸稈降解與秸稈中可培養真菌數不相關。

2.5 不同微生物菌劑處理對秸稈中可培養放線菌數量的影響

從圖5可以看出,在試驗時段的前30 d,放線菌數量快速增加,處理1增加數量明顯高于對照組和處理2;在90～120 d時,三個處理都未能檢測到放線菌,在150～180 d時,三個處理的放線菌數量均同時大量出現,之后對照組和處理1均快速下降,只有處理2呈上升趨勢。分析三個處理的秸稈中90～120 d均未能檢測到放線菌,可能是真菌、細菌大量增加抑制了放線菌的生長所致。

圖5 不同微生物菌劑處理對秸稈中可培養放線菌數量的影響Fig.5 The effect of different microbial agent treatments on the quantity of cultivatable actinomyces in straw

相關性分析表明,前30 d秸稈降解率與秸稈中可培養放線菌數高度相關,相關系數為0.924 5;30 d后,秸稈降解與秸稈中可培養放線菌數不相關。

3 討 論

本研究發現,不同微生物菌劑對秸稈降解作用不同,單獨添加哈茨木霉菌劑處理秸稈能顯著提高秸稈降解率,前期作用尤其明顯;添加哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑降低了秸稈降解率,前期尤其顯著。由于土壤和秸稈中攜帶具有降解秸稈功能的菌群,可能添加的地衣芽胞桿菌與其他秸稈降解微生物競爭養分,抑制了哈茨木霉和其他具有降解秸稈功能的微生物生長。國內外研究表明芽胞桿菌有促進植物生長的作用[28-31],但可能對秸稈降解作用不明顯。

不同處理對秸稈中可培養真菌、細菌、放線菌數量的影響顯著不同。秸稈上生長的各種微生物分泌的酶類對秸稈降解起重要作用,相關性分析表明,在秸稈降解的前30 d,秸稈降解率與秸稈中生長的可培養真菌、細菌、放線菌數量呈顯著正相關。在秸稈分解的其他時間段,秸稈降解率與秸稈中可培養微生物相關性小,可能在秸稈降解的中后期,秸稈降解率與秸稈中不可培養微生物、土壤動物等大量出現有關。

不同微生物菌劑對秸稈中微生物數量變化影響顯著,接種哈茨木霉處理的秸稈中真菌、細菌、放線菌數在前30 d明顯高于對照和哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑處理,差異顯著;可培養細菌數均在120 d左右達到峰值,但是對照組和哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑處理的可培養細菌總數明顯高于哈茨木霉處理;哈茨木霉處理和對照組的可培養真菌總數峰值出現在第90天,哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑處理在第120 天達到峰值,并且哈茨木霉處理和對照組的真菌總數峰值明顯比哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑處理的峰值高;在秸稈降解30 d后,三個處理的秸稈中都未能檢測到放線菌,說明菌數未處于檢測范圍,可能與真菌、細菌數量大量增加后,抑制了放線菌的生長所致。劉佳斌等[32]研究表明,在秸稈還田條件下,玉米抽雄期土壤放線菌數量明顯低于其他生長期,放線菌數量與植物生長期也有關。秸稈降解后期,對照組和哈茨木霉處理的秸稈中放線菌數量均大幅度下降,哈茨木霉+地衣芽胞桿菌混合菌劑處理的秸稈中放線菌數量仍呈上升趨勢,而木霉有防治植物病害作用[33],后期的抑制病害作用可能與放線菌數量的增加有一定關系。