伊犁河流域春季可培養細菌多樣性及其胞外酶檢測

程 剛, 程 艷, 胡海洋, 邢 月, 別爾德別克·庫布加沙

(1.新疆環境保護科學研究院 新疆環境污染監控與風險預警重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆環境保護科學研究院,新疆 烏魯木齊 830011;3.上饒師范學院 生命科學學院,江西 上饒 334001;4.新疆農業大學 水利與土木工程學院,新疆 烏魯木齊 830052;5.新疆農業大學 化學化工學院,新疆 烏魯木齊 830052)

伊犁河位于新疆西北部中亞的伊犁-巴爾喀什湖盆地，是新疆降水量最多的地區，具有亞濕潤的大陸性溫帶氣候特征。伊犁河是典型的干旱半干旱區內陸河流，其流向從東向西，南支特克斯河與東支鞏乃斯河匯合后稱為伊犁河，北支喀什河在雅馬渡匯入，形成伊犁河干流，最終流入哈薩克斯坦境內的巴爾喀什湖[1]。已有研究表明，伊犁河流域整體綜合水質較好，但隨著經濟開發，人為活動加劇，伊犁河流域部分河流面臨水質退化風險[2-4]。當前，伊犁河流域水環境風險防控主要針對水源地、地下水和河流健康風險評價，污染物因子分析和有機污染物溯源等方面[3，5-6]，而對該流域微生物群落結構特征的研究較少。水生生物群落結構可作為流域生態質量評價中的重要指標，被廣泛運用在河流生態系統水環境風險評估中[7]。近年來，伊犁河流域已通過魚類、大型底棲動物和浮游動植物的群落結構完整性來評價伊犁河流域河流的健康狀況[8-11]。細菌作為水生生物中數量最大和功能最多的類群之一，相較其他大型水生生物，水生細菌群落結構組成會隨環境因子及人類活動影響發生改變，但其多樣性損失并不明顯[12-13]。此外，西北高海拔地區河流有著與中東部地區河流顯著差異的外在環境條件，細菌等微生物群落結構以及多樣性有明顯的地域特征，其中蘊含著許多“土著”菌種，功能菌株以及潛在新菌種資源亟待開發[14-15]。運用可培養法對伊犁河流域細菌進行分離鑒定以及系統發育分析，可了解伊犁河流域可培養細菌群落結構信息，獲得該流域珍稀菌種資源。目前，針對伊犁河流域細菌群落結構和菌種資源的研究尚未見相關報道。本研究以伊犁河流域水體和沉積物為研究對象，通過傳統可培養法獲得該流域的可培養細菌群落結構信息，并對分離菌株進行胞外酶活性篩選，以期為伊犁河流域微生物資源的利用、發掘和深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 供試樣品采自新疆伊犁河流域境內河段,于2021年4月在伊犁河流域特克斯河支流(4個樣點)、鞏乃斯河支流(3個樣點)、喀什河支流(4個樣點)以及伊犁河干流(4個樣點),每隔直線距離約45～50 km設置采樣點,沿河采集表層水樣(水下50 cm左右)和水底沉積物(表層0～5 cm)樣品,將樣品裝入50 mL無菌離心管于4 ℃低溫保藏,送至實驗室進行細菌菌株的分離鑒定。

1.1.2 培養基 細菌分離純化培養基[16](g/L):① 溶菌肉湯(LB)培養基:蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 10,瓊脂15,蒸餾水1 L,pH 7.0,121 ℃高壓滅菌15 min;② 胰酪大豆胨(TSA)培養基:胰酪胨15,大豆木瓜蛋白酶消化物5,NaCl 5,瓊脂15,蒸餾水 1 L,pH 7.5,121 ℃高壓滅菌15 min;③營養瓊脂(NA)培養基:牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂15,蒸餾水1 L,pH 7.4,121 ℃高壓滅菌15 min;④ R2A培養基:酸水解酪蛋白 0.5,蛋白胨0.5,葡萄糖0.5,酵母浸粉0.5,可溶性淀粉0.5,丙酮酸鈉0.3,K2HPO40.3,MgSO4·7H2O 0.024,瓊脂15,蒸餾水 1 L,pH 7.4,121 ℃高壓滅菌15 min;⑤ 高氏1號培養基:可溶性淀粉20,KNO31,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,NaCl 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,瓊脂15,蒸餾水1 L,pH 7.5,121 ℃高壓滅菌15 min。⑥細菌胞外酶活性檢測培養基:分別選取分離純化培養基為基礎培養基,在其中添加0.5%(質量分數)可溶性淀粉作為淀粉酶檢測培養基;添加1%(體積分數)的吐溫-60作為酯酶檢測培養基;添加0.5%(質量分數,下同)羧甲基纖維素鈉作為纖維素酶檢測培養基;添加1%木聚糖作為木聚糖酶檢測培養基;添加1.5%明膠作為明膠檢測培養基。

1.1.3 主要試劑與儀器設備 Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(B518255,上海生工生物工程股份有限公司);TaqDNA聚合酶(R001B,寶生物工程(大連)有限公司)。超凈工作臺(SW-CJ-2D,江蘇通凈凈化設備有限公司);微生物培養箱(MJX-160B-Z,上海博迅醫療生物儀器股份有限公司);高壓滅菌鍋(BXM-50VE,上海博迅醫療生物儀器股份有限公司);醫用低溫保存箱(BDF-86H118,濟南鑫貝西生物技術有限公司);高速冷凍離心機(H1850R,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司);PCR儀(WD-9402D,北京六一生物科技有限公司);凝膠成像分析系統(WD-9413B,北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 可培養細菌的分離純化及培養基優勢度指數計算 將每條河流不同樣點采集到的水體和沉積物樣品分別等量混合,水樣取1 mL用0.85%的生理鹽水按照100、10-1、10-2進行梯度稀釋,沉積物稱取約1 g,用2 mL 0.85%(質量分數)的生理鹽水混勻,按照10-2、10-3、10-4進行梯度稀釋,分別涂布于LB、NA、TSA、R2A和高氏1號5種固體培養基上,每個梯度下的樣品涂布3個平板作為平行對照。考慮采樣點春季平均水溫約10 ℃左右,水體pH值約8.0,設置培養溫度32 ℃,涂布平板倒置培養3～7 d。挑取不同的單菌落,劃線純化2～3次,純化后的細菌菌株用含40%甘油的分離純化培養基于-80 ℃保藏。培養基優勢度通過下列公式計算:D=N/NT,其中N為各種培養基分離的細菌種類數量,NT為分離到細菌的全部種類數量[16]。

1.2.2 細菌DNA提取及16S rRNA基因擴增 純培養菌株的DNA提取使用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒并參照說明書進行。采用細菌通用引物[17]27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對純化菌株的16S rRNA序列進行擴增。PCR反應體系(25 μL):DNA模板2 μL,10×PCR緩沖液2.5 μL,10 mmol/L的P1和P2各1 μL,dNTP(10 mmoL/L)2 μL,TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL,補齊滅菌雙蒸水至25 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃延伸8 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。回收純化后的16S rRNA基因PCR樣品送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.3 分離細菌的系統發育和可培養細菌分布狀況分析 測序結果在BLAST(http://www. ncbi. nlm. nib.gov/ blast/ blast.cgi)上進行比對分析,獲得最相近菌株的16S rRNA基因序列。并用MEGA7.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件進行序列分析,用Clustal W進行多序列比對,系統進化矩陣根據Kimura-2模型估算,采用鄰近相連法(Neighbor-Joining method)構建出系統進化樹[18]。將所分離的細菌菌株的序列比對結果進行篩選,利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)軟件進行細菌群落結構分析。

1.2.4 分離細菌的胞外酶檢測分析 淀粉酶、酯酶、纖維素酶、木聚糖酶和明膠酶檢測及驗證方法參照文獻[19-20]進行。活化菌株用滅菌牙簽分別點接于添加酶作用底物的細菌胞外酶活性檢測固體培養基上,32 ℃培養3～7 d。待菌落形成后,觀察菌落周圍是否出現透明圈(水解圈),以此作為分離菌株胞外酶產生標準。測量菌落直徑(d)和透明圈(水解圈)(D)直徑,以D/d的數值大小評價菌株產胞外酶活性的強弱[21]。淀粉酶是用新鮮配置的Lugol′s碘液將菌落染色后,觀察菌落周圍是否出現透明圈(水解圈)進行篩選;明膠酶是用50%(質量分數)的三氯乙酸處理菌落后,觀察菌落周圍是否出現透明圈(水解圈)進行篩選;纖維素酶和木聚糖酶是用1 mg/mL的剛果紅溶液將菌落染色后,觀察菌落周圍是否出現透明圈(水解圈)進行篩選;酯酶可直接觀察菌落周圍是否出現透明圈(水解圈)進行篩選。

2 結果與分析

2.1 培養基優勢度指數分析

本研究選取的LB、TSA、NA、R2A和高氏1號培養基對伊犁河流域細菌的篩選分離結果有明顯差異(表1)。利用可培養法從伊犁河流域共分離得到225株細菌,通過菌落特征和細胞形態學觀察,發現高氏1號和R2A培養基分離到的菌落數最多,菌落形態豐富,其他3種培養基分離到的菌落數較少,菌落形態較單一。從5種培養基分離效果來看,R2A培養基分離得到46株細菌,分屬于19個屬,23個物種,分離效果最好;LB培養基分離得到41株細菌,分屬于10個屬,20個物種,分離效果最差。從5種培養基的優勢度指數計算結果可知,TSA培養基的優勢度指數最高,為0.393,LB培養基的優勢度指數最低,為0.238。

表1 LB、TSA、NA、R2A和高氏1號5種培養基分離細菌的多樣性及優勢度指數Table 1 The diversity and dominant index of isolated bateria on 5 types of different medium (LB, NA, TSA, R2A and Gauze′s No.1 medium)

2.2 可培養細菌的16S rRNA基因序列的系統發育分析

通過可培養法共獲得225株細菌(水樣139株,沉積物86株),其中特克斯河54株,鞏乃斯河62株,喀什河60株,伊犁河干流49株,并分別編號。對純化菌株的16S rRNA基因擴增片段進行序列測定,在BLAST上進行序列同源性比對(表2)。同源比對結果表明,225株細菌分屬于變形菌門γ亞群(Gamma-pseudomonadota,56.44%)、放線菌門(Actinomycetota,18.22%)、厚壁菌門(Bacillota,14.22%)、變形菌門α亞群(Alpha-pseudomonadota,4.89%)、變形菌門β亞群(Beta-pseudomonadota,4%)、擬桿菌門(Bacteroidota,0.44%)和異常球菌-棲熱菌門(Deinococcota,0.44%)等7個大的系統發育類群。其中假單胞菌屬(Pseudomonas,42.22%)作為優勢屬分離頻率最高,共分離得到95株該屬菌株,分屬于26個種。其次是芽胞桿菌屬(Bacillus,9.33%),共分離得到21株該屬菌株,分屬于11個種。不動桿菌屬(Acinetobacter,9.33%)第三,共分離得到21株該屬菌株,分屬于6個種。紅球菌屬(Rhodococcus,4.89%)第四,共分離得到11株該屬菌株,分屬于3個種。除上述檢出的高頻細菌外,還分離得到37個屬的細菌,包括節桿菌屬(Arthrobacter)(8株,3種)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)(7株,3種)、拉思氏菌屬(Rahnella)(7株,1種)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)(4株,2種)、氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)(4株,1種)、假節桿菌屬(Pseudarthrobacter)(4株,2種)、微桿菌屬(Microbacterium)(3株,2種)、鏈霉菌屬(Streptomyces)(3株,2種)、食酸菌屬(Acidovorax)(2株,1種)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)(2株,1種)、考克氏菌屬(Kocuria)(2株,2種)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)(2株)、血桿菌屬(Sanguibacter)(2株,2種)、鞘脂菌屬(Sphingobium)(2株,1種)、氣單胞菌屬(Aeromonas)(1株,1種)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)(1株,1種)、包西氏菌屬(Bosea)(1株)、Cereibacter(1株,1種)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium(1株,1種)、金黃微桿菌屬(Chryseomicrobium)(1株,1種)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(1株,1種)、短小桿菌屬(Curtobacterium)(1株)、奇異球菌屬(Deinococcus)(1株,1種)、杜搟氏菌屬(Duganella)(1株)、Microcella(1株,1種)、Pararheinheimera(1株,1種)、泥單胞菌屬(Pelomonas)(1株)、游球菌屬(Planococcus)(1株)、游動微菌屬(Planomicrobium)(1株,1種)、植物桿菌屬(Plantibacter)(1株,1種)、Proteobacterium(1株)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)(1株)、皺紋單胞菌屬(Rugamonas)(1株,1種)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(1株)、鞘脂單胞菌屬(Sphingopyxis)(1株,1種)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)(1株,1種)、束毛球菌屬(Trichococcus)(1株,1種)。

對分離純化的225株細菌16S rRNA基因擴增片段進行序列測定,在BLAST上進行同源比對,根據菌株的系統發育地位構建系統發育樹,分析其進化關系(圖1)。結果表明,可培養細菌菌株聚類于7個大的分支,變形菌門為最大優勢類群,分屬于變形菌門α亞群(4.89%)、β亞群(4%)和γ亞群(56.44%),三者聚類在進化樹上部的大分枝上,其中變形菌門γ亞群占分離細菌多樣性的主要位置。放線菌門(18.22%)為第二大優勢類群,其次是厚壁菌門(14.22%)。而擬桿菌門(0.44%)和異常球菌-棲熱菌門(0.44%)各自獨占一個分類單元,分散于進化樹的不同分支上。從分離細菌菌株分布狀況來看,特克斯河共分離得到54株細菌,分屬于變形菌門γ亞群(46.30%)、放線菌門(24.07%)、厚壁菌門(12.96%)、變形菌門α亞群(7.41%)、變形菌門β亞群(5.56%)5個大的系統發育類群,22個屬28個種。其中假單胞菌屬作為優勢屬,占特克斯河總分離菌株的40.74%,次之為芽胞桿菌屬占7.41%。鞏乃斯河共分離到62株細菌,分屬于變形菌門γ亞群(51.62%)、放線菌門(19.35%)、厚壁菌門(14.52%)、變形菌門β亞群(8.06%)、變形菌門α亞群(3.23%)和異常球菌-棲熱菌門(1.61%)6個大的系統發育類群,16個屬30個種。其中假單胞菌屬作為優勢屬,占鞏乃斯河總分離菌株的50%,次之為紅球菌屬和芽胞桿菌屬,兩者均占8.06%。喀什河共分離到60株細菌,分屬于變形菌門γ亞群(70%)、放線菌門(21.66%)、厚壁菌門(5%)、變形菌門α亞群(1.67%)和變形菌門β亞群(1.67%)5個大的系統發育類群,12個屬25個種。其中假單胞菌屬作為優勢屬,占喀什河總分離菌株的38.33%,次之是不動桿菌屬,占18.33%。伊犁河干流共分離得到49株細菌,分屬于變形菌門γ亞群(57.14%)、厚壁菌門(26.53%)、變形菌門α亞群(8.16%)、放線菌門(6.12%)和擬桿菌門(2.05%)5個大的系統發育類群,11個屬28個種。其中假單胞菌屬作為優勢屬,占伊犁河干流總分離菌株的38.78%,次之是不動桿菌屬,占16.33%。

圖1 16S rRNA基因部分序列構建的伊犁河流域可培養細菌的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic relationships among cultivable bacterial isolates from Ili River Basin based on the 16S rRNA gene sequences

2.3 伊犁河流域可培養細菌分布狀況分析

通過比較分離菌株的門水平分布(圖2),可見鞏乃斯河樣品中細菌所占優勢類群以及分離菌株數量最多,細菌門水平占比與伊犁河全流域細菌分類基本保持一致,依次為變形菌門γ亞群、放線菌門和厚壁菌門,并且從鞏乃斯河樣品中分離得到了1株異常球菌-棲熱菌門的細菌。特克斯河和喀什河樣品中優勢細菌類群基本保持一致,依次為變形菌門γ亞群、放線菌門和厚壁菌門。樣品中優勢類群比例有一定差異,如變形菌門γ亞群占比升高,其在特克斯河樣品中占46.30%,鞏乃斯河樣品中占51.62%,而喀什河樣品中達到70%。喀什河中放線菌門占比為21.66%,與特克斯河樣品相比有所降低,與鞏乃斯河和伊犁河全流域樣品相比有所增加。除此之外,喀什河樣品中厚壁菌門占比最低,僅占5%,而在特克斯河樣品中占12.96%,鞏乃斯河樣品中占14.52%,伊犁河全流域樣品中占14.22%。

圖2 伊犁河流域可培養細菌的門水平分布示意圖Fig.2 Phylum horizontal distribution of cultivable bacteria in Ili River Basin

從伊犁河干流樣品中分離得到的細菌數量最少,僅為49株,分別歸屬5大細菌類群,依次為變形菌門γ亞群、厚壁菌門、變形菌門α亞群、放線菌門和擬桿菌門,其細菌類群分布與特克斯河、鞏乃斯河、喀什河以及伊犁河全流域相比有明顯差異,其中變形菌門γ亞群所占的比例最高,為57.14%,與其他河流樣品基本保持一致。厚壁菌門和變形菌門α亞群所占比例最高,例如厚壁菌門在特克斯河樣品中占12.96%,在鞏乃斯河樣品中占14.52%,在喀什河樣品中占5%,在伊犁河全流域中占14.22%,而在伊犁河干流樣品中占26.53%。變形菌門α亞群在特克斯河樣品中占7.41%,在鞏乃斯河樣品中占1.61%,在喀什河樣品中占1.67%,在伊犁河全流域中占4%,而在伊犁河干流樣品中占8.16%。放線菌門所占比例最低,例如放線菌門在特克斯河樣品中占24.07%,在鞏乃斯河樣品中占19.35%,在喀什河樣品中占21.67%,在伊犁河全流域中占18.22%,而在伊犁河干流樣品中僅占6.12%。除此之外,從伊犁河干流樣品中分離得到1株擬桿菌門細菌。與特克斯河、鞏乃斯河和喀什河樣品分離結果不同,本研究在伊犁河干流未分離到變形菌門β亞群細菌。

根據已純化菌株的測序結果,最終將伊犁河全流域分離到的225株細菌劃分為84個物種,其中特克斯河28種,鞏乃斯河30種,喀什河25種,伊犁河干流28種(圖3)。由于伊犁河流域三大支流和伊犁河干流地理位置、環境條件的不同,導致4條河流細菌群落結構分布上差異明顯,僅有Pseudomonaslinyingensis在4條河流樣品中均分離到,多數菌種為各河流樣品所特有。特克斯河分布的28種細菌中,與伊犁河干流共有的6種,與鞏乃斯河和喀什河均共有的4種,特克斯河獨有的菌種19種,占分離細菌菌種的22.6%。鞏乃斯河分布的30種細菌中,與特克斯河共有的4種,與喀什河和伊犁河干流均共有的6種,特克斯河獨有的菌種18種,占分離細菌菌種的21.4%。喀什河分布的25種細菌中,與特克斯河共有的4種,與鞏乃斯河共有的6種,與伊犁河干流共有的9種,喀什河獨有菌種13種,占分離細菌菌種的15.5%。伊犁河干流分布的28種細菌中,與喀什河共有的9種外,與特克斯河和鞏乃斯河均共有的6種,伊犁河干流獨有菌種14種,占分離細菌菌種的16.7%。上述結果表明,雖然伊犁河流域三大支流最終匯集成伊犁河干流,但各支流和干流中可培養細菌地域分布性強,不同河流區域具有獨特的細菌菌種分布。

圖3 伊犁河流域可培養細菌菌種分布示意圖Fig.3 Venn diagram of cultivable bacterial species distribution in Ili River Basin

2.4 可培養細菌胞外酶活性測定

從伊犁河全流域的特克斯河、鞏乃斯河、喀什河和伊犁河干流共分離得到225株細菌,隸屬于七大細菌發育類群,41個屬84個種。為深入挖掘伊犁河流域潛在的菌種資源,對已測序菌株進行了胞外酶活性檢測(表3),結果發現具有淀粉酶活性的細菌共有89株,占比39.56%;能夠降解吐溫-60的細菌共有130株,占比57.78%;具有明膠酶活性的細菌共有91株,占比40.44%;具有纖維素酶活性的細菌共有54株,占比24%;具有木聚糖酶活性的細菌共有9株,占比4%。其次,225株細菌中具有2種及以上酶活性的菌株共113株,占總分離菌株的50.22%,其中假單胞菌屬作為優勢屬,共56株,占比49.56%,芽胞桿菌屬15株,占比13.27%。優勢種為Pseudomonaskunmingensis,該菌種有8株具有2種及以上酶活性。初步表明伊犁河流域河流微生物具有較廣泛降解大分子物質的能力。

從上述潛在功能菌株的篩選培養基來源分析(表4)的結果發現,TSA培養基和NA培養基獲得潛在功能菌株的數量最多,含有2種及以上酶活性的菌株在TSA培養基中占比高達68.89%,其次是NA培養基,占比68.18%。而R2A培養基和高氏1號培養基獲得潛在功能菌株數量最低,其中R2A培養基中含有2種及以上酶活性的菌株占比僅30.43%。除此之外,從上述潛在功能菌株的空間分布來看,特克斯河含有2種及以上酶活性的菌株數量最高,占比61.11%。喀什河含有2種及以上酶活性的菌株數量最低,占比43.33%。伊犁河干流相較其他三條河流,水樣中具有2種及以上酶活性的菌株占比最低,為28.57%,而沉積物中具有2種及以上酶活性的菌株占比最高,為67.86%。

表4 不同樣點和培養基中具有胞外酶活性菌株的分布Table 4 Distribution of strains with extracellular enzyme activity in different sample points and medium

3 討 論

對比高通量測序技術(High throughput sequencing,HTS),梯度稀釋加平板涂布的可培養法仍然是分離和獲取環境樣品中微生物菌種資源最簡單有效的方法之一。基于細菌16S rRNA基因分析的HTS技術雖然可以進行特殊基因和生態功能層面的深入研究,但并不能獲取細菌菌種資源,以及分辨特殊近源菌種的毒性強弱[22-24]。本研究利用5種培養基對伊犁河流域水體和沉積物中可培養細菌進行了分離純化。結果表明,不同培養基分離純化伊犁河可培養細菌類群差異明顯,其中R2A培養基分離得到19個屬的細菌,分離效果最好。而TSA培養基分離得到33個種的細菌,培養基優勢度指數最高。除此之外,結合胞外酶活性篩選實驗結果,發現含有2種及以上酶活性的菌株在TSA培養基中占比最高,而R2A培養基占比最低。可培養法雖然不能完整體現環境樣本中真實微生物菌群結構,但運用多種不同類型培養基能部分彌補菌群結構的偏差,為進一步研究該流域細菌生理和生態功能提供菌種資源。

伊犁河流域可培養細菌多樣性較為豐富,分離菌株經16S rRNA基因序列比對及系統進化分析發現,225株細菌歸屬于變形菌門γ亞群(Gamma-pseudomonadota,56.44%)、放線菌門(18.22%)和厚壁菌門(Firmicutes,14.22%)等七大細菌發育類群,共41個屬84個種。其中變形菌門γ亞群和放線菌門為伊犁河流域中的優勢類群,優勢屬為假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和芽胞桿菌屬(Bacillus)。比較特克斯河、鞏乃斯河、喀什河和伊犁河干流細菌群落結構發現,三大支流細菌群落結構大致相同,優勢類群依次為變形菌門γ亞群、放線菌門和厚壁菌門,與伊犁河全流域中優勢類群一致。其中鞏乃斯河分離到的細菌數量和種類最多,并且分離到了1株異常球菌-棲熱菌門(Deinococcota)的細菌。而伊犁河干流分離到的細菌數量和種類較少,其優勢類群中厚壁菌門和變形菌門α亞群(Alpha-pseudomonadota)比例上升明顯。已有研究報道,厚壁菌門在長期工業污染的城市河流的細菌群落中為優勢類群[25-26]。對比同處新疆高海拔地區的開都河細菌群落結構分布,變形菌門α亞群也是其優勢類群,并隨地理距離的增加而增加[14]。其次,從分離細菌菌種的分布情況來看,特克斯河、鞏乃斯河、喀什河三條支流與伊犁河干流菌落構成差異明顯,4條河流共有菌種只有Pseudomonaslinyingensis。4條河流彼此間共有菌種最多為9種,為喀什河和伊犁河干流所共有。喀什河支流與特克斯河和鞏乃斯河形成的伊犁河匯合形成伊犁河干流,兩者屬于流域環境過渡區,細菌菌種構成有部分重疊。但4條河流共有菌種數遠低于每條河流獨有菌種數,表明伊犁河流域細菌菌種的地域分布性強,不同河流具有各自不同的細菌菌種分布。

細菌胞外酶在大分子量聚合物降解過程中發揮重要作用,異養細菌通過胞外酶將水環境中的高聚有機物降解,作為菌株主要碳源和能量來源加以利用[27-28]。本研究選取五種胞外酶檢測培養基檢測分離菌株的胞外酶活性,結果表明,伊犁河流域細菌降解吐溫-60的酯酶、明膠酶和淀粉酶活性較好,木聚糖酶活性較差。胞外酶活性優勢屬為假單胞菌屬和芽胞桿菌屬,其中由于其營養需求簡單,適應力強等特征在自然界中普遍存在,并且經常發現具有降解復雜有機物能力的菌株[29-31]。其中,菌株YL-215(OK147810)含有5種胞外酶活性;菌株YL-89(OK135823)與菌株YL-4(OK136188)的標準菌株相似性<98%,為潛在新種,且含有多種胞外酶活性,值得進一步深入研究。由伊犁河流域水體和沉積物分離的菌株一半以上(50.22%)具備至少2種胞外水解酶活性,表明該流域細菌的生態營養多功能性較高,部分菌株可作為潛在可用種質資源在河流水質凈化及水質檢測方面發揮作用。

本研究通過可培養法對伊犁河流域細菌群落進行了分析,伊犁河全流域的可培養細菌多樣性較豐富,分離得到的225株細菌歸屬于七大細菌類群,41個屬84個種。可培養細菌菌種具有地域分布性強的特點。分離細菌的產胞外酶活性比例較高,具備2種及以上胞外水解酶活性菌株占比達50.22%。運用5種通用培養基獲得了伊犁河流域部分易培養細菌多樣性信息,后續研究可運用高通量測序等技術全面分析該流域微生物群落結構,設置不同培養條件和培養方式,進一步挖掘該流域珍稀菌種資源,為伊犁河流域微生物資源的開發和利用提供前期參考。