釀酒酵母中高效積累β-胡蘿卜素的代謝途徑構(gòu)建

王思懿, 張 悅, 王燕燕, 于 放

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

β-胡蘿卜素(C40H56)是由4個異戊二烯雙鍵結(jié)構(gòu)和2個β-紫羅酮環(huán)結(jié)構(gòu)組成的含有40個碳原子的四萜類化合物,是自然界中最普遍存在也是最穩(wěn)定的天然色素[1-2]。β-胡蘿卜素是維生素A的重要來源,是目前較安全的補充維生素A的產(chǎn)品[3-4],具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、增強免疫、預(yù)防心血管疾病等多種生物功能[5-6],因其無毒、安全、有營養(yǎng)等特點可作為食品添加劑、營養(yǎng)強化劑和醫(yī)藥制劑等使用[7]。經(jīng)濟的快速發(fā)展使人類的生活水平不斷提高,人們更加注重營養(yǎng)保健,對類胡蘿卜素的需求顯著增加,由于天然β-胡蘿卜素生理活性豐富,在眾多類胡蘿卜素中所占市場份額比重很大,市場需求量很高[8]。相比于其他類胡蘿卜素,人們對β-胡蘿卜素更加青睞,尤其是天然β-胡蘿卜素,目前天然的β-胡蘿卜素在市場上一直都處于供不應(yīng)求的狀態(tài),因此尋找一條綠色經(jīng)濟高效的天然β-胡蘿卜素生產(chǎn)途徑將會推動產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。β-胡蘿卜素不能在人體內(nèi)合成,只能從食物中攝取[9]。根據(jù)來源不同,β-胡蘿卜素分為天然提取、化學(xué)合成和微生物發(fā)酵。天然的β-胡蘿卜素可通過從陸地高等植物(如胡蘿卜、玉米、萬壽菊等)、藻類(如杜氏鹽藻[10]、螺旋藻等)以及微生物,如成團泛菌(Pantoeaagglomerans)、三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)、紅酵母(Rhodotorulasp.)[11]、紅法夫酵母(Xanthophyllomyces)等中獲得[12]。化學(xué)合成分為以維生素A為原料或以β-紫羅蘭酮為原料構(gòu)造多聚烯鏈合成全反式β-胡蘿卜素[13-14]。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素比植物、藻類效率更高,比化學(xué)合成法生物學(xué)功能更豐富,從品質(zhì)、技術(shù)、資源和成本等因素考慮均優(yōu)于其他方法[15]。隨著代謝工程的快速發(fā)展,構(gòu)建能夠異源合成β-胡蘿卜素的高產(chǎn)工程菌株已成為當前熱點[16]。如Verwaal等[17]利用紅法夫酵母的β-胡蘿卜素合成途徑相關(guān)酶基因,在釀酒酵母中構(gòu)建出β-胡蘿卜素產(chǎn)量為5.9 mg/g DCW的工程菌。Li 等[18]在釀酒酵母中通過對紅法夫酵母β-胡蘿卜素合成途徑中相關(guān)酶基因相關(guān)密碼子優(yōu)化及過表達獲得產(chǎn)量為0.39 mg/g DCW的工程菌。Xie等[19]由分散的裝配策略構(gòu)建可控β-胡蘿卜素生物合成途徑,通過控制途徑的開關(guān)時間,在搖瓶培養(yǎng)中實現(xiàn)了7.41 mg/g DCW的β-胡蘿卜素。王貝貝等[20]將來源于紅法夫酵母的β-胡蘿卜素合成途徑相關(guān)酶基因?qū)脶劸平湍?獲得能生產(chǎn)1.56 mg/g DCW的β-胡蘿卜素工程菌BW02。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為安全的模式微生物,具有遺傳背景清楚,生長周期短,發(fā)酵密度大,發(fā)酵條件成熟,生物安全性好等優(yōu)良的特性[21]。此外,與釀酒酵母相關(guān)的基因操作手段和載體工具也比較豐富,常被作為一種埋想的宿主[22],釀酒酵母中存在內(nèi)源的MVA途徑,能夠為萜類化合物的合成提供前體異戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)[23],因此在本研究中選擇釀酒酵母進行β-胡蘿卜素的異源生產(chǎn)[24]。為了能夠獲得具有較高β-胡蘿卜素生產(chǎn)能力的釀酒酵母基因工程菌株,利用組成型表達載體pYES2-Kan上的三個不同位點分別插入了釀酒酵母來源的BTS1基因及紅法夫酵母來源的CrtI基因、CrtYB基因,并轉(zhuǎn)化至釀酒酵母MKP-o中,使其進行β-胡蘿卜素的生產(chǎn)。如圖1所示為在釀酒酵母中β-胡蘿卜素的生物合成途徑。本研究中質(zhì)粒的應(yīng)用相比于將β-胡蘿卜素合成基因整合到酵母基因組上進行β-胡蘿卜素的生產(chǎn),可極大增加酵母細胞中轉(zhuǎn)入基因的拷貝數(shù),進而提高釀酒酵母的生產(chǎn)效率;而相比于常用的利用誘導(dǎo)型表達載體來實現(xiàn)β-胡蘿卜素的合成,組成型啟動子的應(yīng)用無需對基因進行誘導(dǎo)表達,在酵母生長的過程中可連續(xù)實現(xiàn)β-胡蘿卜素的積累。研究結(jié)果顯示,該工程菌經(jīng)多次傳代后質(zhì)粒依舊較為穩(wěn)定。因此,該工程菌株的構(gòu)建為后續(xù)高效、低成本合成β-胡蘿卜素奠定了基礎(chǔ)。

圖1 釀酒酵母中β-胡蘿卜素的合成途徑[25]Fig.1 Synthetic pathway of β-carotene in Saccharomyces cerevisiae[25]

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物 釀酒酵母菌株MKP-o、紅法夫酵母菌株、質(zhì)粒pYES2-Kan由實驗室保存。克隆基因所用引物如表1所示。

表1 PCR所用引物Table 1 Primers for PCR

1.1.2 培養(yǎng)基 ①TD培養(yǎng)基: 土豆20%,無水葡萄糖2%;②LB培養(yǎng)基: 蛋白胨1%, 酵母浸粉0.5%, 氯化鈉1%,氨芐青霉素100 mg/L;③YPD完全培養(yǎng)基:胰蛋白胨2%, 酵母浸粉1%,無水葡萄糖2%;④SD-URA篩選培養(yǎng)基: 酵母選擇培養(yǎng)基0.67%(六缺,Ade-Ura-His-Lys-Trp-Leu),葡萄糖2%,Ade 0.004%,His 0.002%,Lys 0.003%,Trp 0.004%,Leu 0.006%(上述培養(yǎng)基各成份占比均為質(zhì)量分數(shù))。上述液體培養(yǎng)基加2% 的瓊脂粉配制成對應(yīng)固體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 PrimeSTAR HS DNA聚合酶和RNA反轉(zhuǎn)錄酶(寶生物工程有限公司,大連);限制性內(nèi)切酶SacI、BamH I、SalI(寶生物工程有限公司,大連);重組酶2×MultiF Seamless Assembly Mix(愛博泰克生物科技有限公司,武漢);氨芐青霉素(索萊寶科技有限公司,北京);β-胡蘿卜素標準品(索萊寶科技有限公司,北京)。高通量組織研磨儀(HF-48,上海賀帆儀器有限公司);PCR擴增儀(BioSafer 9702,賽飛有限公司);臺式高速離心機(H1650-W,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);紫外可見分光光度計(UV2400,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);高速冷凍離心機(TGL-16,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);高效液相色譜(MD-2015 JASCO Corporation,日本分光株式會社)。

1.2 方法

1.2.1 克隆β-胡蘿卜素合成途徑基因 紅法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)在TD液體培養(yǎng)基中20 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng),10 000×g 離心收集菌體,加入與菌體等量酸洗玻璃珠,細胞經(jīng)破碎機振蕩破碎50 HZ 10 min,用Trizol法提取總RNA。釀酒酵母MKP-o在YPD液體培養(yǎng)基中28 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)后破碎細胞提取總RNA。將其反轉(zhuǎn)錄獲得紅法夫酵母與釀酒酵母cDNA模板。分別用TY:BTS1-F-SalI/TY:BTS1-R-SalI,TY:CrtYB-F-BamHI/TY:CrtYB-R-BamH I,TY:CrtI-F-SacI/TY:CrtI-R-SacI擴增獲得BTS1、CrtYB、CrtI基因。以上基因序列均由華大基因測序驗證。

1.2.2 表達載體構(gòu)建 用SacI酶切pYES2-Kan質(zhì)粒,切膠回收SacI切割后的線性表達載體pYES2-Kan和目的基因CrtI,用重組酶50 ℃,30 min將其連接得到重組質(zhì)粒pYES2-Kan-CrtI。用BamH I酶切pYES2-Kan-CrtI質(zhì)粒,切膠回收BamH I切割后的線性表達載體pYES2-Kan-CrtI和目的基因CrtYB,用重組酶50 ℃, 30 min連接得到重組質(zhì)粒pYES2-Kan-CrtI-CrtYB。用SalI酶切pYES2-Kan-CrtI-CrtYB質(zhì)粒,回收用SalI切割后的線性表達載體pYES2-Kan-CrtI-CrtYB和目的基因BTS1,用重組酶50 ℃,30 min將其連接得到重組質(zhì)粒pYES2-Kan-CrtI-CrtYB-BTS1。

1.2.3 酵母轉(zhuǎn)化方法 將菌液收集于50 mL離心管中4 ℃,5 000 r/min離心5 min。棄上清,加入10 mL超純水吹打混勻4 ℃,5 000 r/min離心5 min。棄上清,加入5 mL Buffer A吹打混勻,冰上靜置10 min,4 ℃,5 000 r/min離心5 min。棄上清,加入250 μL Buffer A (成分為1 mL醋酸鋰,1 mL TE,8 mL超純水)吹打混勻后吸取50 μL加入到2 mL離心管中,加入2 μL質(zhì)粒、6 μL DMSO及300 μL Buffer B(成分為100 μL醋酸鋰,100 μL TE,800 μL 50% PEG)快速混勻,于28 ℃培養(yǎng)箱放置30 min后,42 ℃水浴15 min,快速拿出于冰上靜置10 min。4 000 r/min低速離心2 min,剩少量上清與菌體吹打混勻涂板,28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3 d。

1.2.4 產(chǎn)β-胡蘿卜素釀酒酵母工程菌的構(gòu)建 β-胡蘿卜素重組質(zhì)粒的構(gòu)建是基于多片段同源重組的方法。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pYES2-Kan-CrtI-CrtYB-BTS1BTS1-F-SalI/TY:BTS1-R-SalI,TY:CrtYB-F-BamH I/TY:CrtYB-R-BamH I,TY:CrtI-F-SacI/TY:CrtI-R-SacI),篩選獲得釀酒酵母基因工程菌TD。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵方法 從SD-URA固體篩選培養(yǎng)基上挑取驗證正確的陽性單克隆菌株,于相應(yīng)的液體篩選培養(yǎng)基中制備發(fā)酵種子液(28 ℃,180 r/min,24 h)。轉(zhuǎn)移至含50 mL YPD液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中,28 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d,按照5%(體積分數(shù)) 接種量取10 mL種子液接種到含200 mL YPD液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中28 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)。根據(jù)不同發(fā)酵時間取樣,檢測OD600、生物量及β-胡蘿卜素含量。

1.2.6 β-胡蘿卜素產(chǎn)量的檢測方法 稱量2 mL EP管重,取0.5 mL培養(yǎng)的發(fā)酵液12 000 r/min離心3 min,棄上清,無菌水清洗后,烘干至恒重,稱量EP管和菌體總重量后用無菌水溶解12 000 r/min離心3 min,棄上清并用1 mL 3 mol/L HCl重懸細胞,放入沸水浴破胞3 min后,立即放到冰上3 min,12 000 r/min離心3 min棄上清。無菌水洗滌2次后加入1 mL丙酮,超聲10 min至菌體變?yōu)榘咨?2 000 r/min離心5 min,取待測樣品(提取2～3次合并樣品)。待測樣品過0.22 μm有機膜后用高效液相色譜分析β-胡蘿卜素產(chǎn)量。檢測條件:MD-2015檢測器,Unitary C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為V乙腈∶V異丙醇=1∶1,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長450 nm。每個待測樣品進行3個生物學(xué)重復(fù)試驗,β-胡蘿卜素標準品用于定量分析。利用峰面積進行β-胡蘿卜素含量的計算。

1.2.7 工程菌株遺傳穩(wěn)定性檢測 將單菌落挑到5 mL YPD培養(yǎng)基中,每12 h傳代一次,每次轉(zhuǎn)接50 μL進行傳代培養(yǎng),共轉(zhuǎn)接20次,將第5代、第10代、第15代、第20代培養(yǎng)物稀釋10-3倍后分別涂SD-URA平板和YPD平板,28 ℃倒置培養(yǎng)3 d。通過觀察菌株顏色平及板計數(shù)來考察該工程菌株的質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素合成途徑基因的克隆

提取釀酒酵母及紅法夫酵母總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄后以釀酒酵母及紅法夫酵母的cDNA為模板克隆BTS1、CrtYB、CrtI基因。如圖2所示:a為克隆BTS1基因電泳圖,泳道1～6成功克隆出牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因(BTS1)1 008 bp;b為克隆CrtI基因電泳圖,泳道1成功克隆出八氫番茄紅素脫氫酶基因(CrtI)1 749 bp;c為克隆CrtYB基因電泳圖,泳道1～4成功克隆出具有八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素環(huán)化酶的雙功能酶基因(CrtYB)2 022 bp。

圖2 β-胡蘿卜素合成相關(guān)基因電泳圖Fig.2 Electrophoretic diagram of genes related to β-carotene synthesis 圖a中M為Marker,1～6泳道為BTS1基因1 008 bp;圖b中M為Marker,1泳道為CrtI基因1 749 bp;圖c中M為Marker,1～4泳道為CrtYB基因2 022 bpM in figure a is Marker, and 1 008 bp of BTS1 gene is in lane 1-6; M in figure b is Marker, 1 749 bp of CrtI gene is in lane 1; M in figure c is Marker, and 2 022 bp of CrtYB gene is in lane 1-4

2.2 生產(chǎn)β-胡蘿卜素的底盤釀酒酵母細胞構(gòu)建

釀酒酵母MKP-o菌株含有形成萜類化合物的MVA途徑,其萜類生物合成途徑中存在合成萜類的通用前體GGPP。釀酒酵母含有一種GGPP合成酶,由BTS1編碼,能夠?qū)PP轉(zhuǎn)化為GGPP。編碼GGPS的BTS1基因是釀酒酵母合成萜類產(chǎn)物的一個關(guān)鍵酶基因,在工程菌中一般過表達BTS1基因能提高萜類合成分支的代謝通量。為進一步提高BTS1基因,選擇首先過表達來源于釀酒酵母的香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因(BTS1),而后同時引入紅法夫酵母β-胡蘿卜素生物合成途徑所必需的八氫番茄紅素脫氫酶基因(CrtI),以及同時具有八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素環(huán)化酶的雙功能酶基因(CrtYB),進行β-胡蘿卜素的異源生產(chǎn)。

將BTS1、CrtI、CrtYB基因分別插入組成型載體pYES2-Kan中,由PGK1、CCW12、TDH3啟動子分別驅(qū)動表達,得到合成β-胡蘿卜素的重組質(zhì)粒pYES2-Kan-BTS1-CrtI-CrtYB。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母MKP-o獲得工程菌TD,釀酒酵母工程菌株經(jīng)破碎后,PCR驗證出該菌株含有BTS1、CrtI、CrtYB基因,證實重組質(zhì)粒導(dǎo)入成功(圖3)。如圖3所示,泳道1成功擴增出條帶大小1 008 bp的BTS1;泳道2成功克隆出條帶大小1 749 bp的CrtI;泳道3成功擴增出條帶大小2 022 bp的CrtYB。如圖4所示,釀酒酵母MKP-o本身為白色菌落(圖4a),而工程菌株TD菌體顏色相比于原始菌株顯現(xiàn)出明亮的橘紅色,說明能夠生產(chǎn)β-胡蘿卜素(圖4b、c)。

圖3 工程酵母菌落PCR電泳圖Fig.3 PCR electrophoresis of engineered yeast coloniesM:Marker;1:BTS1基因1 008 bp;2:CrtI基因1 749 bp;3:CrtYB基因2 022 bpM:The Marker;1:BTS1 gene 1 008 bp;2:CrtI gene 1 749 bp;3:CrtYB gene 2 022 bp

圖4 酵母菌株培養(yǎng)物顏色比較Fig.4 Comparison of the color of yeast strain cultures

2.3 工程菌TD搖瓶發(fā)酵生長曲線測定

釀酒酵母工程菌TD搖瓶生長曲線如圖5所示。菌株0～12 h處于遲滯期;12～48 h處于對數(shù)生長期,進入大量繁殖階段,繁殖速度旺盛;48～180 h處于平穩(wěn)期,是次級代謝產(chǎn)物合成的有利時期,β-胡蘿卜素作為一種異源合成的次級代謝產(chǎn)物主要在細胞生長的后期積累。因此,菌體越快達到生長后期,β-胡蘿卜素的合成越早,積累也就越多。該工程菌株TD搖瓶發(fā)酵180 h,OD600達到了11.97,且該工程菌株在第二天(約48 h)左右即趨于穩(wěn)定,達到最大生物量,OD600接近12。

圖5 釀酒酵母(TD菌株)生長曲線Fig.5 Growth curve of S. cerevisiae (TD strain)

由此可見,本研究構(gòu)建的釀酒酵母工程菌株生長較快,兩天左右即可進入平穩(wěn)期并能夠積累較多的目標產(chǎn)物β-胡蘿卜素。

2.4 工程菌株β-胡蘿卜素的定量分析

利用高效液相色譜法對工程菌株β-胡蘿卜素進行定量分析,經(jīng)高效液相色譜檢測,如圖6所示,在初始葡萄糖添加量為20 g/L的發(fā)酵條件下,將工程菌株TD發(fā)酵72 h,能生產(chǎn)14.53 mg/g DCW的β-胡蘿卜素。利用組成型表達載體進行β-胡蘿卜素生產(chǎn),不但能夠節(jié)省生產(chǎn)成本,不用額外向發(fā)酵液中添加誘導(dǎo)劑對基因的表達去進行誘導(dǎo),而且能夠縮短發(fā)酵周期,節(jié)約生產(chǎn)時間。

圖6 TD菌株β-胡蘿卜素產(chǎn)量Fig.6 β-carotene production of TD strain

2.5 工程菌株遺傳穩(wěn)定性分析

將基因整合到基因組上雖然遺傳穩(wěn)定,不易突變,但基因的拷貝數(shù)少,對基因功能的應(yīng)用有一定的影響,而轉(zhuǎn)入質(zhì)粒可有效解決轉(zhuǎn)入的外源基因拷貝數(shù)過低的問題。在利用質(zhì)粒進行β-胡蘿卜素異源生產(chǎn)的研究中,前期研究人員多采用誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)建質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入酵母后,通過誘導(dǎo)劑驅(qū)動代謝途徑酶基因的表達,實現(xiàn)目的產(chǎn)物的生產(chǎn)。但誘導(dǎo)型表達載體的弊端是細胞生長和產(chǎn)物合成分兩個階段進行,周期過長,尤其是后期酵母停止生長后,β-胡蘿卜素合成的前體化合物提供不充分,會對β-胡蘿卜素的合成效率帶來影響。因此,若能通過組成型啟動子驅(qū)動代謝途徑酶基因的表達,并構(gòu)建相應(yīng)表達載體,有望解決拷貝數(shù)不足以及使用誘導(dǎo)型啟動子所遇到的問題。由于生產(chǎn)過程中采用的生產(chǎn)培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富,因此質(zhì)粒在如YPD等營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中能否保持穩(wěn)定,是該方法能否進一步應(yīng)用生產(chǎn)β-胡蘿卜素的前提和基礎(chǔ)。

為檢測質(zhì)粒的穩(wěn)定性,在YPD液體培養(yǎng)基中將工程菌株TD進行了傳代培養(yǎng),取第20代培養(yǎng)物涂板,以驗證β-胡蘿卜素生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性。如圖7所示,20次傳代后的菌株呈現(xiàn)橘紅色,具備合成β-胡蘿卜素的能力。浙江大學(xué)謝文平[26]將釀酒酵母工程菌在YPD培養(yǎng)基中傳至20代,在第20代的平板上,大約出現(xiàn)了1/800的白色菌落突變,其余菌落均能合成β-胡蘿卜素。與其研究結(jié)果一致,本研究構(gòu)建的工程菌TD遺傳穩(wěn)定性較好,具備連續(xù)工業(yè)生產(chǎn)的潛力。

圖7 TD菌株第20次傳代平皿培養(yǎng)物 Fig.7 TD strain 20th generation plate culture

將工程菌傳至20代,記錄營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基篩選平板中的菌落數(shù),進一步計算出質(zhì)粒保有率,如圖8所示,第20代工程菌株質(zhì)粒穩(wěn)定性達到95%以上。夏詔杰[27]構(gòu)建的釀酒酵母基因工程菌在無選擇性壓力的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 h后(約3代)質(zhì)粒保有率最高可達到80%,培養(yǎng)130 h后(約10代)質(zhì)粒幾乎完全丟失,而在具有選擇性壓力的SSM培養(yǎng)基中培養(yǎng),重組酵母的質(zhì)粒穩(wěn)定性在整個培養(yǎng)過程中保持90%以上。Ro等[28]構(gòu)建的利用pESC-Leu2d表達紫穗槐二烯合酶 (ADS)的工程酵母菌株在無選擇性壓力的YPG培養(yǎng)基中培養(yǎng)144 h(約12代)的質(zhì)粒穩(wěn)定性達到84%。與上述研究相比,本研究構(gòu)建的工程菌遺傳穩(wěn)定性更高。

圖8 TD菌株質(zhì)粒傳代穩(wěn)定性Fig.8 Stability of plasmid passage of TD strain

通常情況下,工業(yè)用菌需要驗證質(zhì)粒遺傳的穩(wěn)定性,質(zhì)粒保有率不低于90%,經(jīng)過10代以上穩(wěn)定篩選之后才用于小試、中試和工業(yè)生產(chǎn)的。如陸文淵等[29]構(gòu)建的基因工程菌在無抗生素壓力下連續(xù)傳代20代,質(zhì)粒保有率為100%,顯示此工程菌可滿足擴大生產(chǎn)的需要。郝丹等[30]研究表明在無抗生素選擇壓力下,工程菌連續(xù)傳代20代保持100%的分裂穩(wěn)定性,可以滿足擴大生產(chǎn)的需要。康小燕等[31]研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pACYC184雖表現(xiàn)出一定的分離不穩(wěn)定性,但仍然能夠在無抗生素選擇壓力條件下每4 h傳一代,培養(yǎng)200 h內(nèi)保持質(zhì)粒的基本穩(wěn)定遺傳,穩(wěn)定性已足夠滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。李曉丹等[32]構(gòu)建的重組CCT酶基因的工程菌在無抗生素選擇壓力的培養(yǎng)條件下,傳代20代后開始出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的細胞,連續(xù)傳代50次后仍保留重組質(zhì)粒,保有率為90%,表明此工程菌適合于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究構(gòu)建的釀酒酵母工程菌每12 h傳一代,共計培養(yǎng)240 h連續(xù)傳代20代,第10代酵母菌株質(zhì)粒保有率為100%,第20代酵母菌株質(zhì)粒保有率也能達到95%以上,具備大規(guī)模生產(chǎn)的潛力。證實該菌株能夠穩(wěn)定高效生產(chǎn)β-胡蘿卜素,有望將其應(yīng)用于工業(yè)化對β-胡蘿卜素進行大規(guī)模生產(chǎn)。

3 討 論

本研究利用釀酒酵母表達真核生物紅法夫酵母來源的β-胡蘿卜素合成基因,將BTS1、CrtI、CrtYB基因分別插入組成型載體pYES2-Kan中,由PGK1、CCW12、TDH3組成型啟動子分別驅(qū)動表達,得到合成β-胡蘿卜素的組成型重組質(zhì)粒pYES2-Kan-BTS1-CrtI-CrtYB,從而在釀酒酵母中構(gòu)建β-胡蘿卜素的生物合成途徑。釀酒酵母基因工程菌株TD搖瓶發(fā)酵72 h,能生產(chǎn)14.53 mg/g DCW的β-胡蘿卜素。而劉潔等[33]克隆來自鎖擲酵母的類胡蘿卜素相關(guān)酶基因整合到巴斯德畢赤酵母基因組中能生產(chǎn)3.7 mg/g DCW的β-胡蘿卜素。相比之下,本研究通過重組質(zhì)粒的高拷貝提高基因表達,進而提高酵母的生產(chǎn)效率具有優(yōu)越性。王瑞釗等[34]在釀酒酵母δ位點整合紅法夫酵母來源的β-胡蘿卜素合成基因(CrtE、CrtI、CrtYB)并通過增加前體供應(yīng)得到產(chǎn)β-胡蘿卜素的釀酒酵母工程菌,利用40 g/L葡萄糖作為碳源,將其搖瓶發(fā)酵120 h后能生產(chǎn)21.6 mg/g DCW的β-胡蘿卜素;Zhao等[35]向釀酒酵母基因組中引入紅法夫酵母β-胡蘿卜素合成基因構(gòu)建了一株組成型生產(chǎn)β-胡蘿卜素的釀酒酵母工程菌株,搖瓶發(fā)酵72 h生產(chǎn)出8.98 mg/g DCW的β-胡蘿卜素;Bu等[36]構(gòu)建的釀酒酵母基因工程菌株搖瓶發(fā)酵72 h能生產(chǎn)11.4 mg/g DCW的β-胡蘿卜素。本研究構(gòu)建的釀酒酵母工程菌TD僅利用20 g/L的葡萄糖作為碳源,搖瓶發(fā)酵72 h即可得到14.53 mg/g DCW的β-胡蘿卜素。工程菌TD的優(yōu)勢在于用更短的發(fā)酵時間以及更少量的碳源即可獲得較高的β-胡蘿卜素含量,為后續(xù)通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化進而提高目的產(chǎn)物含量創(chuàng)造了提升空間。

綜上所述,在釀酒酵母中利用組成型重組質(zhì)粒pYES2-Kan-BTS1-CrtI-CrtYB進行β-胡蘿卜素的異源生產(chǎn)具有獨特優(yōu)勢,不僅能夠節(jié)省工業(yè)生產(chǎn)成本,還能夠縮短發(fā)酵周期。該組成型重組質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定,不易丟失,與整合基因組相比,基因的拷貝數(shù)更多,與誘導(dǎo)型載體相比,無需菌體生長與產(chǎn)物合成分段進行,且無需額外誘導(dǎo)即可穩(wěn)定高效生產(chǎn)β-胡蘿卜素。該工程菌在2 d左右即可達到較高的菌體濃度,并能夠完成目的產(chǎn)物的合成從而達到較高的β-胡蘿卜素產(chǎn)量。本研究構(gòu)建的菌株為后續(xù)通過發(fā)酵條件的優(yōu)化、上游代謝通路編輯等手段,高效、低成本生產(chǎn)β-胡蘿卜素提供參考。