一種測定農藥氨基寡糖素含量的高效液相色譜方法

鄧曉嬌，顏聰，薛建強，潘朝暉

(江蘇龍燈化學有限公司，江蘇 昆山 215300)

氨基寡糖素(amino-oligosaccharin)也稱為農業專用殼寡糖，是從海洋生物如蝦類、蟹類等的外殼提取而來的多糖類天然產物，由幾丁質降解得殼聚糖后再降解制得的，或由微生物發酵提取的低毒殺菌劑，其不僅可刺激植物生長，使農作物增產，還有抑制植物病毒的作用，對小麥花葉病、棉花黃萎病、水稻稻瘟病、番茄疫病等具有良好的防治作用[1-2]。目前已進行了大面積推廣應用，對低毒高效農藥的發展具有十分重要的意義。

關于氨基寡糖素產品中氨基寡糖素含量的測定，目前主要采用分光光度法[3-4]、離子色譜法等[5-6]。分光光度法是將氨基寡糖素經鹽酸水解為氨基葡萄糖，氨基葡萄糖經衍生反應后用顯色劑顯色，然后在特定波長處測定吸光度，但該方法干擾因素多，穩定性較差。離子色譜法使用脈沖安培檢測器和高效陰離子交換柱測定氨基寡糖素水解產物氨基葡萄糖，但離子色譜價格高昂，對企業適用性較差。基于此，為了滿足企業日常分析需求，降低分析檢測成本，本文采用高效液相色譜儀建立一種與NY/T 2889—2016[6]中離子色譜法結果一致、水解時間更短的氨基寡糖素含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC20A 液相色譜儀配PDA 檢測器[島津(中國)有限公司]；XS 205 型分析天平[梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司]；SK5200 型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；有機過濾器(孔徑0.45μm)。HH-5C 型數顯恒溫油浴鍋(常州市頂新實驗儀器有限公司)；Smart-S30 實驗室超純水系統(上海和泰儀器有限公司)。

氨基葡萄糖鹽酸鹽標樣(質量分數≥99.0%，SIGMA 試劑公司)；氨基寡糖素母藥(質量分數≥85.0%，濰坊華諾生物科技有限公司)；8%氨基寡糖素可溶液劑(江蘇龍燈化學有限公司研發小樣)；乙腈，色譜純；甲醇、三氯甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，均為分析純；超純水。

1.2 檢測方法

氨基寡糖素用8 mol/L 鹽酸水解成氨基葡萄糖，水解得到的氨基葡萄糖用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)進行衍生，用三氯甲烷萃取除去過量的PMP 后，衍生物經高效液相色譜分離，用PDA 檢測器檢測，外標法測定。

1.3 測定步驟

1.3.1 樣品水解

稱取相當于氨基寡糖素0.02 g 的樣品于水解管中，加8 mol/L 鹽酸5.0 mL，混勻，充入高純氮氣，密封。于(98±2) ℃油浴中水解4 h，每小時搖動1 次樣品。取出水解管，于流水下冷卻。將水解管中水解液轉移至100 mL 燒杯中，用5 mL 超純水洗滌水解管3 次，洗滌液并入100 mL 燒杯中。向燒杯中加入10 mol/L 氫氧化鈉4 mL，用0.3 mol/L 氫氧化鈉或0.3 mol/L 鹽酸調pH 至7.0。將燒杯中溶液轉移至100 mL 容量瓶，燒杯用5 mL 超純水洗滌3 次，洗滌液并入100 mL 容量瓶中，冷卻用超純水定容至刻度，得到樣品水解溶液，備用。

1.3.2 標樣制備

稱取約0.4 g 氨基葡萄糖鹽酸鹽試樣(氨基葡萄糖鹽酸鹽轉換成氨基葡萄糖的系數為0.830 9)于100 mL容量瓶中，用超純水溶解，定容至刻度，得到質量濃度約3.3 mg/mL 氨基葡萄糖貯備液。取6 只100 mL容量瓶，分別移取氨基葡萄糖貯備液0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，用超純水定容至100 mL，得到質量濃度為0、33、66、132、198、264 mg/L 氨基葡萄糖標準溶液，備用。

1.3.3 衍生和萃取

取不同質量濃度的氨基葡萄糖標準溶液各0.50 mL和各樣品水解溶液0.50 mL 分別置于數只10 mL 具塞比色管中，每個比色管中加入0.5 mol/L PMP 甲醇溶液0.50 mL 和0.3 mol/L 氫氧化鈉溶液0.50 mL，混勻，于(70±2)℃水浴衍生60 min。取出，流水下冷卻至室溫，加0.3 mol/L 鹽酸溶液0.50 mL，搖勻。再加4.0 mL 三氯甲烷萃取3 次，取上層水相用0.45μm濾頭過濾，得到質量濃度為0、33、66、132、198、264 mg/L 的氨基葡萄糖-PMP 標準待測液6 份和樣品的待測液若干。

1.3.4 色譜分析

色譜柱SB-C18150 mm×4.6 mm，i.d.5μm；流動相：乙腈+磷酸二氫鉀緩沖液=15+85(體積比)；流速1.0 mL/min；測定波長254 nm；進樣體積5μL。在上述色譜操作條件下，氨基葡萄糖-PMP 衍生物保留時間約為17.5 min。

待儀器穩定后連續注入數針標樣溶液，直至相鄰2 針氨基葡萄糖-PMP 標準待測液標的響應值相對變化＜10%后，按照先各標準待測液后樣品待測液的順序測定，以儀器上測定的氨基葡萄萄糖-PMP標準待測液的質量濃度(mg/L)為橫坐標，液相色譜吸光度為縱坐標繪制標準曲線。氨基葡萄糖標樣-PMP 及氨基寡糖素樣品-PMP 的典型液相色譜圖見圖1。

圖1 氨基葡萄糖標樣-PMP 和氨基寡糖素樣品-PMP 的色譜圖

1.3.5 計算

將樣品峰面積帶入標準曲線計算出相應樣品待測液中氨基葡萄糖質量濃度C(mg/L)，試樣中氨基寡糖素的質量分數ω(%)按下式計算：

式中：ω為氨基寡糖素質量分數(%)；C 為樣品待測液的質量濃度(mg/L)；m為樣品的實際稱樣量(g)；100 為樣品的稀釋倍數；k為校正系數，氨基寡糖素在降解為氨基葡萄糖過程中的損失k=1.7(參照NY/T 2889—2016中離子色譜法計算系數)；10-6為mg/L換算成g/mL 值。

2 結果與討論

2.1 水解條件

2.1.1 水解酸度

實驗選用6、8、12 mol/L 的鹽酸在(98±2)℃油浴中對氨基寡糖素母藥進行水解(圖2)。可見，在6 mol/L 鹽酸水解液中，氨基寡糖素水解緩慢。在12 mol/L 鹽酸水解液中，氨基寡糖素水解速度快，但是其水解產物氨基葡萄糖易被破壞。而在8 mol/L鹽酸水解液中樣品水解程度高且水解產物氨基葡萄糖在一段時間內穩定，易于檢測。

圖2 水解酸度對氨基寡糖素含量測定的影響

2.1.2 水解時間

樣品加8 mol/L 鹽酸溶液5.0 mL 在(98±2)℃油浴中分別水解1、2、3、4、5、6、7、8 h 后測定氨基寡糖素含量。以水解時間為橫坐標，氨基寡糖素含量為縱坐標，繪制關系圖(圖3)。可見，樣品水解4～8 h 測定的氨基寡糖素含量達到峰值。為更快得到較優水解樣品，選擇水解時間為4 h。

2.1.3 衍生時間

各選擇1 份水解4 h 的氨基寡糖素可溶液劑和氨基寡糖素母藥的水解液與PMP 衍生試劑在(70±2)℃水浴中衍生，分別衍生30、50、60、70 min，實驗結果如圖4。可見，(70±2)℃水浴衍生60 min后樣品中的氨基葡萄糖與PMP 能反應完全。

圖4 衍生時間對氨基寡糖素含量測定的影響

2.2 線性關系

氨基葡萄糖鹽酸鹽經水解、衍生、萃取、過濾得到6 份質量濃度為0、33、66、132、198、264 mg/L氨基葡萄糖標準-PMP待測溶液，每個待測液取5μL注入高效液相色譜儀測量保留時間和峰面積，每個質量濃度測定2 次，取峰面積平均值，以質量濃度(mg/L)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明：氨基葡萄糖質量濃度在1～264 mg/L 線性相關性良好，回歸方程y=11 451x-2 318.1，線性相關系數為0.999 9。

2.3 方法精密度

在上述色譜條件下稱取約0.3 g 的氨基寡糖素可溶液劑和0.02 g 氨基寡糖素母藥各7 份，按2.3 節步驟處理后測定，結果見表1。氨基寡糖素母藥的相對標準偏差為0.69%，理論相對偏差1.34%；氨基寡糖素可溶液劑的相對標準偏差為1.43%，理論相對偏差1.95%；均符合要求。

表1 分析方法的精密度

2.4 方法回收率

稱取10 份取氨基寡糖素母藥(每份約0.015 g)，均分成2 組：第1 組每份各加3.3 mg 氨基葡萄糖，按2.3 節步驟水解處理后衍生測定加標回收率；第2組樣品先按2.3.1 節步驟水解，再加3.3 mg 氨基葡萄糖后衍生測定加標回收率，氨基寡糖素水劑樣品操作同氨基寡糖素母藥。結果表明：氨基寡糖素母藥和氨基寡糖素可溶液劑的水解加標回收率分別為95.1%～98.2%和95.2%～99.4%，水解后加標衍生的回收率分別為97.6%～104.1%和98.5%～103.8%。

2.5 與離子色譜法結果比對

同一批氨基寡糖素母藥和氨基寡糖素可溶液劑樣品按照NY/T 2889—2016 中離子色譜法分析，其中氨基寡糖素母藥和氨基寡糖素可溶液劑的含量分別為99.6%和8.0%，與本試驗中的98.1%和8.3%的結果差值在5%以內，2 種方法測定結果一致性高。

3 結論

本文建立了一種可以簡單快速分析氨基寡糖素的高效液相色譜檢測方法，目標物在測試濃度范圍內線性關系良好、方法精密度和準確度高，且水解時間短，適用于氨基寡糖素產品中有效成分的快速檢測與分析。