牛大力水提物對斑馬魚抗氧化和免疫能力的影響*

韋天立,陳慶師,劉淑林,吳金霞,鄒記興,謝少林**

(1.華南農業大學,廣東廣州 510665;2.廈門大學,福建廈門 361001)

近年來,隨著養殖環境的日益惡化,水產養殖動物病害頻發;同時由于傳統抗生素具有易殘留和產生耐藥性等缺點,水生動物食品安全備受人們的關注[1]。中草藥作為代替抗生素的一種選擇,具有一定的營養、抗菌、抗病毒以及提高機體免疫力的作用[2]。牛大力是一味藥食兩用的中草藥,為豆科(Fabaceae Lindl.)蝶形花亞科(Papilionoideae)崖豆藤屬(MillettiaWight &Arn.)植物美麗崖豆藤(MillettiaspeciosaChamp.,MSP)的干燥根,別名九龍串珠、甜牛大力、山蓮藕、牛古大力等,主要分布于廣西、廣東、海南等地[3]。現代藥理學研究表明MSP具有提高抗氧化能力[4-9]、抗應激[10]、抗疲勞[11]、抗腫瘤[12]、保肝[13-15]以及降低血糖[16]的作用,由于其經濟營養,人們更是將其做成膳食用來強身健體[17,18]。目前,牛大力中草藥研究主要集中在對小鼠免疫和疾病等方面的影響。斑馬魚(Daniorerio)作為一種常見的動物模型,近年來被廣泛用于藥物研究[19]。基于此,本研究將MSP水提物通過浸浴的方式添加到斑馬魚的養殖水體中,探討MSP對斑馬魚抗氧化和免疫能力的影響,為MSP在水產養殖中的應用提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 MSP水提物提取

MSP購買于廣州海王星辰藥店,MSP水提物的提取參考文獻[20],具體方法如下:準確稱取MSP 10 g,切成小碎塊,以20倍體積量的雙純水100 ℃回流煎煮1 h,煎煮完將溶液倒出,重復提取1次,合并兩次所得濾液,濃縮為生藥量的1/10 (g/mL),于4 ℃保存備用。

1.2 試驗設計

本試驗的基礎飼料為每日孵化的鮮活豐年蟲,試驗所用斑馬魚為3月齡野生型斑馬魚,養殖試驗開始前暫養10 d。將300尾健康斑馬魚[體長(3.0±0.2)cm,體質量(0.50±0.05) g]隨機分為5組,參考周楚瑩等[15]的試驗結果進行濃度設置,設置0(空白對照組)、5、15、25和35 mg/L MSP水提物試驗組,每組60尾并設置3個平行,每個平行20尾,分別放置于含3 L水的玻璃缸(20 cm×20 cm×15 cm)中進行試驗。斑馬魚飼養用水為養殖過濾水,水溫控制在26-28 ℃,溶氧6.5-7.0 mg/L,同時24 h增氧,每天換水量為2/3(水體積);試驗過程中采用自然光照。所有組均投喂豐年蟲,每天投喂量為魚體總質量的5%,早上9:00和下午5:00投喂,每天下午飼喂完試驗組后加入相應濃度的MSP水提物,試驗共進行14 d。

1.3 樣品采集與攻毒試驗

養殖試驗結束后,禁食24 h,每個平行處理組隨機選取9尾魚,冰上麻醉之后,用無菌無酶的采樣工具采集肝臟、腸道和腦組織,分別放入無菌無酶的1.5 mL離心管中,其中肝臟和腸道1尾1個樣,腦組織3尾混為1個樣,置于液氮速凍2 h后,于-80 ℃保存用于之后的分子實驗;另取魚的肝臟和腸道,均為3尾混為1個樣,分別置于無菌無酶的1.5 mL離心管中,存于-20 ℃冰箱中,用于測定組織的抗氧化酶活力。

采樣結束后,從每個平行處理隨機選取10尾斑馬魚,每組合計為30尾魚,進行嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)攻毒試驗。致病性嗜水氣單胞菌由華南農業大學海洋學院水產養殖系提供。菌種用LB培養基在28 ℃搖床培養24 h,復壯2次后將菌體以4 000 r/min離心10 min,用生理鹽水清洗收集到的沉淀菌體,再進行梯度稀釋,稀釋后的濃度為預試驗確定的半致死濃度4.2×108CFU/mL。攻毒試驗采用斑馬魚尾部創傷感染的方法,將創傷后的斑馬魚放進半致死濃度的嗜水氣單胞菌菌液中,感染3 min后轉入飼養缸中,感染期間不間斷充氣、每天換1/2體積的水。每6 h觀察一次,及時撈出死魚,記錄和統計各組死魚的數量,攻毒試驗共進行7 d。

1.4 組織生理生化指標測定

采用相應的試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)檢測腸道和肝臟組織總抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity,T-AOC)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量,以及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、溶菌酶(Lysozyme,LZM)的活性,試驗步驟按試劑盒的操作說明進行。

1.5 組織免疫基因表達測定

利用Trizol試劑(杭州艾科瑞生物科技有限公司)提取斑馬魚的肝臟、腸道和腦組織總RNA,用EvoM-MLV反轉錄預混型試劑盒(杭州艾科瑞生物科技有限公司)將提取的RNA轉錄成cDNA,接著用SYBR GreenProTaqHS預混型q-PCR試劑盒(杭州艾科瑞生物科技有限公司)以β-actin為參照基因檢測白細胞介素-1 (Interleukin-1)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α)、溶菌酶、防御素(Defensins)、核轉錄因子κB(Nuclear factor κB)、補體(Complement)、干擾素(Interferon)等基因(分別簡寫為il-1β、tnf-α、lyz、defbl1、nfκb、c3a、ifnγ)的相對表達量,引物序列如表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

續表

1.6 數據處理

實驗結果用均值±標準差表示,采用SPSS Statistics 19.0軟件通過單因素方差分析(Duncan多重比較法)進行統計學分析,P<0.05表示具有統計學意義。

存活率(%)=(存活尾數/總尾數)×100%,免疫保護率(%)=[(空白對照組死亡數-藥物實驗組死亡數)/空白對照組死亡數]×100%。

2 結果與分析

2.1 MSP水提物對斑馬魚生理生化指標的影響

不同濃度MSP水提物對斑馬魚腸道和肝臟生理生化指標的影響見表2。腸道SOD的活性在5 mg/L和15 mg/L組均顯著高于空白對照組(P<0.05),分別比對照組提高60%和192%,35 mg/L組顯著低于空白對照組(P<0.05);腸道MDA的含量在5 mg/L組和空白對照組間有顯著性差異(P<0.05),其余各組影響較小;腸道LZM的活性隨著MSP水提物濃度的增大整體上先降低后增高,在5、15、25 mg/L組均顯著低于空白對照組,35 mg/L組顯著高于空白對照組(P<0.05)。肝臟SOD的活性在25 mg/L組顯著高于空白對照組(P<0.05),比空白對照組提高581%;肝臟LZM的活性在25 mg/L組最低,和空白對照組間有顯著性差異(P<0.05);各濃度MSP水提物試驗組中肝臟T-AOC均高于空白對照組,在25 mg/L組有顯著性差異(P<0.05),高出空白對照組16倍。

表2 斑馬魚的組織生理生化指標

2.2 MSP水提物對斑馬魚免疫相關基因表達的影響

2.2.1 MSP水提物對斑馬魚腸道部分免疫相關基因表達的影響

斑馬魚腸道部分免疫相關基因的相對表達量如圖1所示。從圖1可知,tnf-α的相對表達量在5 mg/L和25 mg/L組中均顯著高于空白對照組(P<0.05);nfκb的相對表達量在25 mg/L組顯著高于空白對照組(P<0.05),35 mg/L組顯著低于空白對照組(P<0.05),其余各組影響不大;defbl1的相對表達量隨著MSP水提物濃度的增加整體上先升高后降低,其中5、15、25 mg/L組均與空白對照組有顯著性差異(P<0.05);各濃度MSP水提物試驗組斑馬魚腸道lyz的相對表達量均高于空白對照組,其中5、25、35 mg/L組均顯著高于對照組(P<0.05);il-1β的相對表達量在5 mg/L和35 mg/L組均顯著高于空白對照組(P<0.05);c3a的相對表達量除了15 mg/L組其余均顯著低于空白對照組(P<0.05),同時整體上呈現出隨著MSP水提物濃度的增高而不斷降低的趨勢。

Different letters superscripted on different groups of the same gene indicate significant differences (P<0.05).

2.2.2 MSP水提物對斑馬魚肝臟部分免疫相關基因表達的影響

斑馬魚肝臟部分的免疫相關基因的相對表達量如圖2所示。從圖2可知,各濃度MSP水提物試驗組斑馬魚肝臟tnf-α的相對表達量均高于空白對照組,在5 mg/L組和空白對照組間有顯著性差異(P<0.05);nfκb的相對表達量和空白對照組差異不大;defbl1的相對表達量在5 mg/L和35 mg/L組均顯著高于空白對照組(P<0.05);lyz的相對表達量在25 mg/L組顯著高于空白對照組(P<0.05),其余各組均低于空白對照組;il-1β的相對表達量在25 mg/L和35 mg/L組均顯著高于空白對照組(P<0.05);c3a的相對表達量整體上呈現先升高后降低的趨勢,在5 mg/L組顯著高于空白對照組(P<0.05)。

Different letters superscripted on different groups of the same gene indicate significant differences (P<0.05).

2.2.3 MSP水提物對斑馬魚大腦部分免疫相關基因表達的影響

斑馬魚大腦部分免疫相關基因的相對表達量如圖3所示。tnf-α的相對表達量隨MSP濃度的增加而上調,同時在15 mg/L和35 mg/L組相對表達量均顯著上調(P<0.05);nfκb的相對表達量在35 mg/L組顯著高于空白對照組(P<0.05);和空白對照組相比,defbl1在25 mg/L組相對表達量最低,35 mg/L組相對表達量最高(P<0.05);ifny的相對表達量均高于空白對照組,在5、25、35 mg/L組均顯著高于空白對照組(P<0.05);il-1β的相對表達量在5 mg/L和15 mg/L組均高于空白對照組;c3a的相對表達量呈現平緩上調的趨勢,在35 mg/L組顯著高于空白對照組(P<0.05)。

Different letters superscripted on different groups of the same gene indicate significant differences (P<0.05).

2.3 MSP水提物對斑馬魚感染嗜水氣單胞菌的保護率

由表3可知,所有試驗組斑馬魚的存活率隨MSP水提物濃度的增加而提高,35 mg/L組的存活率(67%)最高。斑馬魚攻毒免疫保護率隨MSP水提物濃度的增加而不斷提高,35 mg/L組的免疫保護率最高,為28.6%。

表3 試驗組和空白對照組斑馬魚攻毒后的存活率

3 討論

3.1 MSP水提物可以提高斑馬魚組織的抗氧化能力

氧化應激反應是指體內氧化與抗氧化作用失衡,傾向于氧化,機體所做出的反應。T-AOC是指各種抗氧化物質和抗氧化酶等構成的總抗氧化水平。SOD是動物機體一種較為重要的抗氧化酶,可通過清除生物體內的自由基來增強機體免疫力[21]。MDA是氧化應激過程產生的代表性毒性中間產物,其含量過高會損傷細胞[22]。LZM屬于非特異性免疫因子,是一種能水解病原微生物細胞壁中黏多糖的堿性酶,對動物腸道有免疫屏障的作用[23]。研究表明,在飼料中添加中草藥可以提高牙鲆(Paralichthysolivaceus)[24]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[25]以及草魚(Ctenopharyngodonidella)[26]組織的SOD、LZM活性和T-AOC,使魚機體的抗氧化能力得到提高。研究表明牛大力具有抗氧化能力,主要是通過其所含的多糖、總黃酮、多酚等化學成分清除自由基來實現[27,28]。本研究中,MSP水提物試驗組斑馬魚腸道和肝臟中的SOD活性顯著高于空白對照組,同時35 mg/L組斑馬魚腸道中的MDA含量低于空白對照組,LZM活性在高濃度MSP水提物組顯著提高,肝臟的T-AOC高于空白對照組,表明MSP水提物能提高斑馬魚的抗氧化能力,增強斑馬魚應對外界應激的能力。

3.2 MSP水提物通過調控斑馬魚的相關免疫基因增強其免疫力

tnf-α在炎癥反應、細胞免疫、腫瘤免疫、低氧及血脂異常等多種生理和病理過程中發揮著關鍵作用[29]。il-1β是多功能細胞因子之一,參與機體的炎癥反應、細胞生長和組織修復等多項生理過程[30]。nfκb在細胞的炎癥反應、免疫應答等過程中起到關鍵性作用[31,32]。defbl1是一組在宿主先天性免疫防御中發揮重要作用的小抗菌肽,是許多物種先天免疫系統的一部分;過表達的defbl1能抑制病毒感染和上調宿主免疫相關基因的表達[33]。補體C3為補體系統中含量最高的成分,在C3轉化酶的作用下,其裂解成c3a和c3b兩個片段,在先天性免疫中有重要的作用[34,35]。ifnγ作為驅動細胞免疫的關鍵參與者,主要通過增強抗原加工和呈遞、增加白細胞運輸,誘導抗病毒狀態,增強抗微生物功能以及影響細胞增殖和凋亡來發揮其免疫調節作用[36]。藥理學研究表明MSP具有調節免疫應答的能力,主要是通過調節腸道微生物群落的多樣性,進而增強腸道健康來實現[37,38]。本研究中,高濃度MSP水提物干預可上調斑馬魚組織中的tnf-α、il-1β、nfκb、defbl1、ifnγ、lyz、c3a的相對表達量,特別是,在腸道中25 mg/mL組的大部分免疫相關基因顯著性高于空白對照組;在肝臟中25 mg/mL MSP水提物試驗組也有類似的趨勢,表明MSP水提物主要是通過腸-肝軸調節斑馬魚的免疫應答能力。而在腦組織中,35 mg/mL MSP水提物試驗組對tnf-α、nfκb、il-1β、c3a、ifnγ、defbl1的調節較其他濃度MSP水提物組更顯著,表明高濃度的MSP水提物可能通過血腦屏障產生免疫調節作用。此外,MSP水提物對斑馬魚感染嗜水氣單胞菌的保護試驗也表明MSP水提物對斑馬魚具有一定的保護效果,這可能是MSP水提物干預后顯著上調相關免疫調節因子,有效提高了斑馬魚的免疫力,從而抵抗外界病菌的侵入。

4 結論

本研究中,MSP水提物對斑馬魚的組織生化指標、免疫基因的表達量和抗嗜水氣單胞菌感染的能力具有明顯的改善作用,能夠增強斑馬魚的抗氧化和免疫能力。