化瘀止血膠囊的薄層鑒別及急性毒性實驗研究

謝嘉馳 羅黎霞 羅純清 楊 寧

湖南省湘潭市中醫醫院藥學部，湖南 湘潭 411100

化瘀止血膠囊處方來源于我院醫生的長期臨床實踐總結，并以協定處方的形式在院內使用多年。由三七、白及、蒲黃炭、延胡索四味藥組成，具有化瘀止血、消腫定痛功效，臨床上治療胃出血疾病效果顯著。為解決湯劑給臨床用藥帶來的不便，我院按照相關技術原則將其開發成院內制劑——化瘀止血膠囊。本課題組前期已對大鼠胃出血模型進行了臨床實驗研究，結果顯示化瘀止血膠囊具有良好的療效。

此外，查閱國內文獻，發現三七制劑可能引發胃腸道刺激[1]、出血、過敏反應[2]，其中以皮膚損害最為常見[3]；延胡索制劑可致嚴重藥物性肝損傷[4-6]，這些制劑的不良反應是影響臨床安全用藥的重要因素。因此，為控制該制劑產品質量，保證臨床療效和安全用藥，本課題對三七、延胡索進行了薄層色譜鑒別，并參照《藥物單次給藥毒性研究技術指導原則》的相關規定[7]，采用大鼠急性毒性試驗探討其安全性[8-9]，為該制劑的質量控制及臨床用藥安全提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 PL2001-L型電子天平(上海甄明科學儀器有限公司)；SKG-01型電熱恒溫鼓風干燥箱(湖北省黃石市恒豐醫療器械有限公司)；DS-0405超聲波清洗機(深圳品凰科技有限公司)；CX23LEDRFSIC顯微鏡[奧林巴斯(中國)有限公司]，CP214型電子天平(美國Ohaus公司)；ZF-2型三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠)。

1.2 材料 三七對照藥材(批號：120941-201108)、延胡索對照藥材(批號：120928-201311)由中國食品藥品檢定研究院提供。化瘀止血膠囊(湘潭市中醫醫院制劑室，批號：20131201)；羧甲基纖維素鈉(上海山浦化工有限公司，批號：20141201)；甲醇(天津科賽歐，批號：200304)；甲苯(國藥集團，批號：20180111)；乙酸乙酯(批號：20181129)、二氯甲烷(批號：20201212)，均購自于廣東光華科技有限公司；正丁醇(批號：20220305)、乙醚(批號：20220319)、丙酮(批號：20190105)，均購自于天津富宇精細化工有限公司，以上試劑均為分析純。

1.3 動物 SPF級雌雄各半的費城癌癥研究所(簡稱：ICR)小鼠各20只，小鼠重量：18.0～20.0 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，試驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2013-0004。動物實驗室溫度：20～26 ℃，動物實驗室濕度：40%～70%，換氣次數：≥15次/h，動物試驗流程及相關操作遵守《實驗動物管理條例》。

2 方法與結果

2.1 三七的薄層鑒別 取內容物5 g，加40 mL甲醇，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，加水20 mL使殘渣溶解，每次用20 mL水飽和的正丁醇萃取，萃取3次，將正丁醇液合并，用20 mL氨試液洗滌，再用20 mL飽和的水正丁醇洗滌，洗滌2次，將正丁醇液蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，即為供試品溶液。另取缺三七陰性樣品，同法制成缺三七陰性樣品溶液。再取三七對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照2015版《中國藥典》(四部通則0502)試驗，分別吸取4 μL的供試品、陰性樣品、對照藥材溶液，點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)的下層溶液為展開劑，10 ℃以下放置2 h，展開，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾。如圖1所示。

1 2 3 4 51.陰性樣品溶液；2.三七對照藥材溶液；3～5.供試品溶液圖1 三七TLC鑒別圖

2.2 延胡索的薄層鑒別 取內容物10g，研細，加50 mL甲醇，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，加10 mL水使殘渣溶解，加濃氨試液調至堿性，用 10 mL 乙醚振搖萃取，萃取3次，將乙醚液合并，蒸干，加1 mL甲醇使殘渣溶解，即為供試品溶液。另取缺延胡索陰性樣品，同法制成缺延胡索的陰性樣品溶液。再取延胡索對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照2015版《中國藥典》(四部通則0502)試驗，分別吸取上5 μL的供試品、陰性樣品、對照藥材溶液，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(9∶2)為展開劑，展開，晾干，再置于碘缸中約3 min取出，將板上吸附的碘揮盡后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且陰性無干擾。如圖2所示。

1 2 3 4 51.陰性樣品溶液；2.延胡索對照藥材溶液；3～5.供試品溶液圖2 延胡索TLC鑒別圖

2.3 小鼠急性毒性試驗[10-18]

2.3.1 最大給藥量實驗 將雌雄各20只SPF級ICR的小鼠按性別、體重隨機方法分為兩組，即為空白對照組和化瘀止血膠囊組。實驗前禁食12 h以上，按40 mL/kg劑量經口灌胃分別給予空白對照品組和化瘀止血膠囊組，給藥當日給藥2次，間隔6 h，化瘀止血膠囊組累積劑量為10.0 g生藥/kg，具體試驗劑量及分組情況見表1。給藥當天，尤其在給藥后0～4 h內密切觀察并記錄各組小鼠一般活動狀況、中毒表現和特點、毒性反應出現及恢復時間以及死亡情況等。然后每天觀察1次，連續觀察14 d。分別于給藥前及給藥后第7天、第14天，使用電子天平對小鼠體重進行稱量。所有小鼠在試驗結束后腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉處死，并予以大體解剖，肉眼觀察各臟器的位置、大小、色澤、粘連等情況，并檢查臟器表面和切面的質地、積液及腫瘤等異常改變。在試驗過程中若有非計劃死亡的動物(包括瀕死動物)，均應進行大體解剖。

表1 試驗劑量及分組設計

2.3.3 結果

2.3.3.1 一般活動狀況及死亡情況 在灌胃給藥后0～4 h內和連續14 d觀察期間，空白對照組和化瘀止血膠囊組小鼠自主活動如常，未見明顯異常和死亡現象。

2.3.3.2 體重變化情況 分別于給藥前、給藥后第7天和第14天稱重，結果與空白對照組比較，化瘀止血膠囊組小鼠體重變化無顯著性差異，且體重在正常增長范圍內，說明ICR小鼠經口灌服化瘀止血膠囊，給藥當日給藥2次，累積劑量10.0生藥/kg，對小鼠體重增長無明顯影響。具體見表2、表3、表4。

表2 化瘀止血膠囊對小鼠體重影響

表3 化瘀止血膠囊對雌性小鼠體重影響

表4 化瘀止血膠囊對雄性小鼠體重影響

2.3.3.3 大體解剖檢查結果 肉眼觀察各臟器表面和切面均未見明顯異常情況。

3 討論

化瘀止血膠囊方中三七化瘀止血、活血止痛，為君藥；白及收斂止血、消腫生肌，止血同時促進恢復，延胡索活血、行氣、止痛，兩者配合三七化瘀止血，行氣止痛，為臣藥；蒲黃止血、化瘀，調血而兼止，為佐藥。諸藥合并，化瘀止血、消腫定痛。根據湖南省藥品監督管理局《湖南省醫療機構應用傳統工藝配制中藥制劑備案管理實施細則》的規定，薄層鑒別應首選處方中君臣藥。故采用TLC法鑒別化瘀止血膠囊中三七、白及、延胡索藥味，建立其TLC色譜方法學研究。

在三七的薄層鑒別試驗中，參考《中國藥典》2015版一部，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)為展開劑，結果發現該展開劑中三氯甲烷毒性大。后經查閱文獻，選用二氯甲烷代替三氯甲烷為展開劑進行試驗，結果顯示斑點清晰，專屬性強，且展開劑毒性降低，故納入質量標準。在延胡索的薄層鑒別試驗中，選用延胡索對照藥材作為對照，結果顯示，與對照品色譜相應的位置上，主斑點明顯，故納入質量標準。處方中白及薄層分離效果差，且陰性干擾嚴重，故未列入質量控制標準。因此，將三七、延胡索列入質量標準。經試驗，該方法操作簡便、準確度高、重復性好、專屬性強。

本課題組在前期已對化瘀止血膠囊的止血治療作用進行了研究，顯示對胃出血其具有較好的治療作用。在肯定其療效的前提下，對該制劑的安全性進行評價。結果在本試驗條件下，ICR小鼠經口灌胃給予化瘀止血膠囊(0.125 g生藥/mL)，最大劑量40 mL/kg，每天給藥2次(累積劑量為10.0 g生藥/kg)，對其一般活動狀況和體重量增長無明顯影響，未見明顯急性毒性反應。根據《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》[10]，計算出小鼠最大給藥量相當于70 kg成人臨床擬用量的130倍，提示化瘀止血膠囊口服用藥安全性較高，可為臨床應用安全性提供依據。