克霉唑陰道乳膏的使用中穩定性研究

廖志剛,葉德曉,游澤芳

(廣東華潤順峰藥業有限公司,廣東 佛山 528000)

使用中穩定性是已上市藥品在臨床使用過程中的穩定性,包括醫院臨床用藥期間的穩定性和患者在家使用中的穩定性。需要進行使用中穩定性考察的藥物包括多劑量包裝藥物、臨床前需重新配制藥物、部分高阻隔包裝的藥物及部分需再處理的口服固體制劑等。關于使用中穩定性試驗的考察目的,ICH、WHO、EMEA、FDA和NMPA均有相關指南描述。其中ICH Q1A(R)《新原料藥和制劑穩定性試驗》中的制劑章節中明確規定:在稀釋或配伍后的藥物進行使用中穩定性試驗,建立一個使用期限(in-use period),為說明書或標簽提供關于制備、貯存條件、配伍后藥物的使用期限等信息[1]。WHO在2018年更新發布的《原料藥及藥品的穩定性測試》中對藥物使用中穩定性考察要求盡可能地模擬實際使用的過程,檢測藥品制劑使用期間的化學、微生物和物理特性等項目。WHO指導文件草案212110條款中描述對多劑量藥物在開啟包裝第一次使用后,建立一個使用期限,在該時間期限內制劑可以在保證質量的前提下繼續使用。EMA在2001年發布的《關于人用藥物使用期間穩定性試驗的指導文件》中明確了使用中穩定性的概念,同時較為詳細地描述了使用中穩定性考察的試驗設計、試驗參數、批次的選擇、試驗的對象、試驗條件、分析過程、數據描述和數據評價等。FDA明確規定對于多劑量包裝的軟膏、氣霧劑等創面用制劑和無菌眼用制劑,在存放和使用過程中易淚液、受創傷面及環境中微生物的污染,均應進行使用中穩定性考察?！吨袊幍洹?020版通則9001“原料藥物與制劑穩定性試驗指導原則”要求部分藥物制劑應考察臨用時配制和使用過程中的穩定性。《化學藥物(原料藥和制劑)穩定性研究技術指導原則》明確了使用中穩定性的研究對象為臨用現配的制劑,或是多劑量包裝開啟后有一定使用期限的制劑;并指出長期穩定性試驗的放置條件及考察時間要充分考慮貯藏和使用的整個過程。同時,《已上市化學藥品藥學變更研究技術指導原則》和《創新藥(化學藥)臨床試驗期間藥學變更技術指導原則》等多個指導原則均提出部分藥物還應進行藥物使用中穩定性研究,但缺少具體詳細的描述。

本次研究用藥品為陰道用克霉唑陰道乳膏,在注冊申報的使用中穩定考察中依據原研產品說明書和國內外指南要求設計,全面評價了產品的使用中穩定性,保證產品在開封后的有效性和安全性,為產品的開封后的使用期限提供依據。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

顯微鏡(DM70,德國徠卡(Leica)儀器有限公司);高效液相色譜儀(Agilent 1200,安捷倫科技有限公司);高效液相色譜儀(Agilent 1260,安捷倫科技有限公司);數顯黏度計(DV-S,廣州艾欣科學儀器有限公司);pH計(S220-B,梅特勒-托利多儀器有限公司);超聲波清洗器(KQ3200,昆山市超聲儀器有限公司);流變儀(MCR102e,安東帕);多功能透皮擴散儀(SYT-103,延吉艾迪扼科技有限公司)。

1.2 試劑藥品

克霉唑陰道乳膏(廣東華潤順峰藥業有限公司生產,1%,30 g/支,20210601批和20210602批留樣12月樣品);克霉唑陰道乳膏(加拿大拜耳,1%,GP01Z3H批);鄰苯二甲酸氫鉀標準緩沖液(pH值4.003);磷酸鹽標準緩沖液(pH值5.865);磷酸氫二鉀(化學純,廣州化學試劑廠);磷酸二氫鉀(化學純,廣州化學試劑廠);四丁基硫酸氫銨(化學純;上海阿拉丁生化科技股份有限公司);磷酸(化學純,廣州化學試劑廠);聚乙二醇400(化學純,上海凌峰化學試劑有限公司);乙腈(色譜純,上海星可高純溶劑有限公司);甲醇(色譜純,上海星可高純溶劑有限公司);克霉唑對照品(中國食品藥品檢定研究院);苯甲醇對照品(中國食品藥品檢定研究院);克霉唑雜質A對照品(CTAO);TSA培養基、SDA培養基、TSB培養基、SDB培養基、CAM培養基、MSA培養基。

1.3 方案設計

根據克霉唑陰道乳膏說明書中描述“(1)陰道內給藥,每天用藥1次,每次5 g,連續治療6 d;(2)陰道外給藥,每天用藥1～2次,每次適量,連續治療不超過7 d”,并模擬產品在臨床中使用的實際過程,從放置條件、取樣時間點和考察項目進行產品使用中穩定性試驗方案的設計。

放置條件設計:依據產品說明書的貯藏環境及實際使用過程中的環境進行設置,克霉唑陰道乳膏兩批樣品的放置條件為室溫。

試驗時間區間和取樣時間點設計:依據產品說明書的使用說明和實際使用過程,為保證產品在該期限內的有效性和安全性,試驗時間區間設置為30 d,使用過程中產品穩定性試驗共包括9個取樣點(每次取樣每管取樣約1 g或5 g,剩余樣品擰蓋密封好,繼續于試驗條件放樣),取樣點設計如表1所示。

表1 試驗時間區間和取樣點設計

考察項目設計:使用中穩定性試驗考察項目需選擇最能反映該過程變化以及產品使用有效性和安全性的項目。本產品的考察項目涉及外觀性狀、均勻性、分層現象、乳滴、含量、有關物質、黏度、酸堿度、微生物、流變學性質、體外釋放。不同取樣時間點所考察的項目有所不同,其中第0天、第6天、第30天進行全部項目的檢測,第15天進行外觀性狀、均勻性、分層現象、乳滴、含量、有關物質、黏度、酸堿度項目檢測,1,2,3,4,5 d只進行外觀性狀的檢測,對于考察項目的限度參考內控質量標準限度。

2 方法和結果

2.1 性狀、均勻性、分層現象

采用目視法對兩批0,1,2,3,4,5,6 ,15,30 d取樣點的樣品進行性狀觀察,0,6,15,30 d取樣點樣品進行均勻性和分層現象的檢測。結果顯示:性狀結果均為白色乳膏;均勻性結果為均涂布于手上觀察基質均勻、膏體細膩,無刺激性;分層現象結果為膏體無油水分離的分層現象。性狀、均勻性、分層現象均符合標準要求。

2.2 乳滴

取0,6,15,30 d取樣點樣品的乳膏適量置于載玻片上,用蓋玻片蓋住,置于顯微鏡下觀察,觀察并統計乳滴粒徑分布。結果如表2所示,兩批樣品乳滴大小均勻,大多數乳滴在5 μm以內,視野中存在有極少數6～10 μm的大乳滴,符合標準要求。

2.3 黏度

取0,6,15,30 d取樣點樣品適量,照黏度測定法(《中國藥典2020年版》四部通則0633第三法)測定。結果如表3所示,兩批樣品開封使用后黏度與0 d相比有上升趨勢,但均符合標準要求,說明使用過程中產品的黏度較穩定。

表3 克霉唑陰道乳膏黏度測定結果 單位:Pa·s

2.4 酸堿度

取0,6,15,30 d取樣點樣品,依法測定(《中國藥典2020 年版四部》通則0631)。結果如表4所示,兩批樣品開封使用后酸堿度與0天相比有下降趨勢,但仍均符合標準要求,說明使用過程中酸堿度較穩定。

表4 克霉唑陰道乳膏酸堿度測定結果

2.5 含量與鑒別

采用高效液相色譜法(《中國藥典》2020年版通則0512)測定產品中克霉唑和苯甲醇的含量,色譜柱(Waters XBridge Shield RP184.6 mm×150 mm 5 μm),檢測波長:215 nm,流速:1.0 mL/min,柱溫:30 ℃,進樣體積10 μL,試劑為磷酸氫二鉀和乙腈。含量測定項下的色譜圖中,供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致,按外標法以峰面積計算供試品中克霉唑和苯甲醇的含量。結果如表5所示,兩批樣品開封后克霉唑含量具有下降趨勢,第30天為標示量的99.6%,符合標準要求;苯甲醇含量在0.1～0.2 mg間波動,與0 d相比無明顯上升或降低趨勢,各時間點均符合標準要求。

表5 克霉唑陰道乳膏含量測定結果

2.6 有關物質

采用高效液相色譜法(《中國藥典2020年版四部》通則0512)測定產品中有關物質。使用甲醇處理供試樣品、克霉唑對照品、克霉唑雜質A對照品;色譜柱(Ultimate XB-C84.6 mm×150 mm 5μm),捕集柱(Ghost-Buster Column Ⅱ 3.0 mm×50 mm);檢測波長:210 nm,流速:1.0 mL/min,柱溫:40 ℃,進樣體積10 μL,試劑為磷酸二氫鉀、四丁基硫酸氫銨和乙腈。測定結果如表6所示,兩批開封后使用樣品的有關物質總雜與0 d相比在0.024%～0.068%之間波動,雜質A在0.001%～0.007%波動,其他未知單雜在0.002%～0.042%波動,無明顯上升或降低趨勢,符合標準要求。

表6 克霉唑陰道乳膏有關物質質量含量測定結果 單位:%

2.7 微生物

采用微生物培養法測定產品中的微生物,對兩批樣品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白念珠菌進行測定。結果如表7所示,兩批樣品開封使用后需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白念珠菌與0 d相比無變化,抑菌能力穩定,限度均符合標準要求。

表7 克霉唑陰道乳膏微生物測定結果

2.8 流變學特性

采用安東帕MCR102e流變儀測定產品中的流變學特性,測定兩批樣品的黏度曲線、3ITT觸變性、振幅掃描、屈服應力。結果如表8所示,兩批開封前后的樣品均為假塑性流體,平均黏度與0 d相比有上升趨勢,與2.3用黏度計測定的結果相似;3ITT觸變性(δ)在0.25～13.90間波動,無明顯變化趨勢;振幅掃描下線性粘彈區兩批樣品的變化趨勢存在差異,但仍在變化范圍中,20210601批儲能模量為下降趨勢,20210602批整體為上升趨勢;屈服應力兩批整體呈上升趨勢,說明需要增加應力才能發生流動,但在變化范圍內。兩批開封前后的流變特性整體上與0 d相比較穩定。

表8 克霉唑陰道乳膏流變學特性測定結果

2.9 體外釋放

采用Franz擴散池法測定制劑的體外釋放情況,使用中穩定性樣品的釋放度與參比制劑的0 d進行平行比較。釋放透皮介質:30%聚乙二醇400-磷酸二氫鉀溶液,體外釋放擴散體積:1.5 cm2,轉速:600 r/min,擴散池溫度:37 ℃。色譜柱(Agilent HPH-C82.7 μm 4.6 mm×100 mm),柱溫:30 ℃,流速:1.0 mL/min,進樣體積:10 L,檢測波長220 nm,試劑為磷酸二氫鉀、四丁基硫酸氫銨、乙腈。結果如表9所示,兩批樣品的體外透皮釋放速率與0 d相比均無明顯變化,與參比制劑GP01Z3H批0 d釋放速率的置信區間在75%～133.33%范圍內,說明開封前后制劑的體外釋放穩定。

表9 克霉唑陰道乳膏體外釋放測定結果(對照樣品/參比制劑GP01Z3H批0 d)

3 討論

對國內使用中穩定性研究的文獻進行檢索,發現我國目前對藥物制劑使用中的穩定性研究較少,僅10余篇報道,且多集中于注射劑和粉劑溶解后的使用中穩定性研究,缺少對多劑量包裝的半固體制劑的研究[2]。在臨床使用過程中,對于多劑量包裝制劑,在初次使用后會接觸到環境中的氧氣、水分、光線和微生物等,可能會影響制劑的外觀色澤、含量、有關物質和微生物等,從而對藥物的安全性和有效性產生影響。為此,合理設計藥物使用中穩定性的研究方案,開展使用中穩定性研究,指導臨床用藥安全,保證使用中藥物的有效性。

1%克霉唑陰道乳膏(30 g/支)作為多劑量包裝的藥物制劑,本研究對兩批經過12月留樣的中試規模樣品,滿足了國內申報穩定性樣品及EMA和FDA指導原則的要求。此外,WHO、EMA和ICH等均推薦貨架期末的樣品進行試驗,但在實際注冊申報中無法得到貨架期末的數據,也推薦提供12月或注冊申報時長期穩定性的最后一個時間點的穩定性數據,該情況建議對穩定性數據進行分析有無下降趨勢,視情況是否補充貨架期末的使用中穩定性數據[3]。依據產品說明書模擬臨床實際使用過程在實際使用條件下每次取樣,試驗放置條件為室溫環境,試驗時間區間設置為30 d,共9個取樣點,覆蓋了說明書中“陰道內給藥,連續治療6 d”和“陰道外給藥,連續治療不超過7 d”的時間。考察項目根據乳膏劑型進行設計,限度參考產品的質量標準,從而保證藥物使用中的安全性和有效性,包含了最能反映使用過程中穩定性變化的項目,如有關物質、外觀性狀;乳膏劑型的質量特征的項目,如均勻性、分層現象、乳滴、黏度、酸堿度、流變學特性;藥品有效性的項目,如克霉唑含量、體外釋放;藥品安全性的項目,如微生物;還有使用期間抑菌劑苯甲醇含量的變化。

4 結論

本研究結果顯示,1%克霉唑陰道乳膏(30 g/支)2批樣品在開封后30 d內不同時間點的質量考察項目,制劑的外觀性狀、均勻性、分層現象、乳滴、含量、有關物質、黏度、酸堿度、微生物均符合標準要求,6 d和30 d的流變學特性與0 d相比無明顯變化趨勢,6 d和30 d的體外釋放速率與0 d和參比制劑0 d相比無明顯變化。使用中穩定性數據表明在臨床實際使用過程中,克霉唑陰道乳膏在開封后30 d內質量穩定,藥物具有良好的安全性和有效性。