大接骨丹樹皮藥材質量標準研究

伍小艷,石偉,韓忠耀

(1.桂林市衛生學校,廣西 桂林 541006;2.廣西師范大學,廣西 桂林 541006;3.黔南民族醫學高等專科學校,廣西 都勻 558000)

民族藥大接骨丹樹皮來源于山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的干燥樹皮,其根皮收載于貴州省地方藥、民族藥標準《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》(2003版)[1]。據文獻報道,大接骨丹樹皮具有抗炎鎮痛活性[2]。目前,大接骨丹樹皮未被歷版《中國藥典》和地方標準收載,根據貴陽中醫學院編著《中華本草》(苗藥卷)記載和相關文獻報道,民族藥大接骨丹樹皮具有藥用開發價值,具有替代用藥部位根皮的潛在價值[3-4]。

據相關研究報道,大接骨丹主要含有4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛[5]、Griselinoside[6]、紫丁香苷[6]、Coniferin[6]、Quercetin-3-O-glucoside[6]、Astragalin[6]、Phytol[6]、黑麥草內酯[7]、蘋果酸甲酯[7]、griselinoside[7]等化學成分。當前,有齒鞘柄木相關研究主要集中指紋圖譜[8-13]、工藝優化[14]、近紅外快速分析[15-17]、質量標準與質量標準提升[18-19]、生物活性[20]、含量測定[21-22]、液質聯用成分分析研究[23-24]、譜效關系探究[25]、生藥學研究[26]等,而關于大接骨丹樹皮藥材質量標準研究,尚未見報道。

本試驗擬以黔產大接骨丹樹皮藥材為研究對象,按照國家藥品標準及相關文獻,對6批次大接骨丹樹皮藥材進行薄層色譜定性鑒別,水分、總灰分、浸出物的含有量檢測,同時,建立HPLC法測定大接骨丹樹皮藥材紫丁香苷的含量,為民族藥大接骨丹樹皮藥材質量標準制定與質量控制提供參考與試驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型HPLC分析儀(DAD檢測器,美國安捷倫科技有限公司);FA2125型電子天平(十萬分之一,上海舜宇恒平科學儀器有限公司);SX-4-10型箱式電阻爐(天津市泰斯特儀器有限公司);101-3AB型烘箱(天津市泰斯特公司);三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司);DY-D2電熱恒溫水浴鍋(上海勝啟儀器儀表有限公司);JP-020超聲儀(深圳潔盟清洗設備有限公司);蒸發皿;坩堝等。

1.2 試藥

紫丁香苷對照品(購自成都克洛瑪生物科技有限公司,批號為:160120);硅膠GF254薄層板(上海艾研生物科技有限公司);甲醇(天津科密歐化學試劑有限公司,分析純);乙腈(天津科密歐化學試劑有限公司,色譜純);水為自制蒸餾水,其他試劑均為分析純。

6批大接骨丹樹皮藥材均為自采(見表1),所有自采藥材均黔南民族醫學高等專科學校藥物化學與藥物分析教研室韓忠耀教授鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的樹皮。

表1 大接骨丹樹皮藥材來源

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒

按照文獻相關方法[18-19],取大接骨丹樹皮藥材粉末2 g,置圓底燒瓶中,加甲醇50 mL,水浴回流提取60 min,濾紙過濾,濾液置坩堝中,水浴蒸干(水浴溫度≤70 ℃),放冷至室溫,殘渣用移液槍加入甲醇2 mL,溶解,制備成供試品溶液,即得;參考文獻[18]方法,取適量紫丁香苷標準品,加甲醇制成每1 mL含該成分約為1 mg的溶液,即得紫丁香苷標準品溶液。參照2020版《中國藥典》(四部)0502薄層色譜測定法[27]并參考文獻[19]方法,吸取供試品溶液、對照品溶液各5 μL,點于同一硅膠GF254薄層板上,按照參考文獻[18]薄層層析展開劑條件為本試驗展開劑,展開、晾干,紫外光燈254 nm下檢視,在供試品、對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的藍紫色熒光斑點,見圖1。噴以10%硫酸乙醇溶液,用吹風機加熱數分鐘至斑點顯色清晰,在供試品、對照品色譜相應的位置上顯相同灰藍色斑點,見圖2。

圖1 大接骨丹樹皮藥材TLC熒光(254 nm)結果

圖2 大接骨丹樹皮藥材TLC(10%硫酸乙醇)結果

2.2 檢查項及浸出物

2.2.1 水分測定

參照2020版《中國藥典》(四部)通則0832水分測定法第二法(烘干法)[27]并參考文獻[18-19]相關方法,進行水分檢查,各批次平行2份,結果見表2。根據檢測結果,初步擬定大接骨丹樹皮藥材水分含有量不得超過12.0%。

表2 6批大接骨丹樹皮藥材水分含量、浸出物含量及灰分含量測定結果

2.2.2 總灰分測定

參照2020版《中國藥典》(四部)通則2302總灰分測定法[27]并參考文獻[18-19]相關方法,進行總灰分檢查,各批次平行2份,結果見表2。根據檢測結果,均值為6.03%,以總灰分不超過平均值的120%為限度計算,初步擬定大接骨丹樹皮藥材總灰分含有量不得超過7.23%。

2.2.3 浸出物測定

參照2020版《中國藥典》(四部)2201浸出物測定法(熱浸法)[27]并參考文獻[18-19]相關方法,進行浸出物測定,溶劑為70%乙醇,各批次平行2份,結果見表2。根據檢測結果,均值為21.10%,以浸出物不少于平均值的70%為最低限度要求計算,初步擬定大接骨丹樹皮藥材浸出物含有量不得少于14.77%。

2.3 紫丁香苷含量測定

2.3.1 色譜條件

參照《中華人民共和國藥典》(2020年版,四部,0512高效液相色譜法測定)[27]及文獻按照文獻[19,21]相關方法,紫丁香苷HPLC檢測條件:Agela Promosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長210 nm,進樣量5 μL,柱溫35 ℃,體積流量為1.0 mL·min-1,流動相為0.5%-磷酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫條件,見表3。

表3 接骨丹樹皮藥材HPLC梯度洗脫程序

在此條件下,紫丁香苷理論塔板數大于4 000,與相鄰成分色譜峰的分離度大于1.5,色譜圖見圖3。

圖3 對照品(A)與供試品(B)的 HPLC圖

2.3.2 對照品溶液的制備

按照文獻相關方法[19,21],取紫丁香苷標準物質適量,精密稱定,置于25 mL白量瓶中,加入甲醇,搖勻,即得對照品儲備溶液(每1 mL含1.235 3 mg的紫丁香苷)。

2.3.3 供試品溶液的制備

按照文獻相關方法[19,21],精密稱取藥材粉末(過50目篩孔孔徑0.282 mm藥典篩)約0.5 g,精密稱定,記錄稱樣量,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇50 mL,水浴回流提取60 min,過濾于50 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾,取續濾液,即得。

2.3.4 線性關系考察

按照文獻相關方法[19,21],精密量取“2.3.2”項下標準品儲備溶液0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL,分別置于5 mL量瓶中,用分析純甲醇稀釋至刻度,搖勻,按“2.3.1”項下色譜條件和表3流動相梯度洗脫方法,以紫丁香苷峰面積為縱坐標(Y),溶液的質量濃度為橫坐標(X)作線性回歸方程,得到紫丁香苷線性回歸方程為Y=2 927.4X-17.227(r=0.999 9),線性范圍為0.123 5～1.235 3 mg/mL。

2.3.5 精密度試驗

按照文獻相關方法[19,21],精密吸取“2.3.4”項同一質量濃度的對照品溶液(3號線性紫丁香苷標準品溶液),按“2.3.1”項下色譜條件和表3流動相梯度洗脫方法,連續進樣6次,測得紫丁香苷色譜峰面積RSD為1.88%(n=6),結果表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗

按照文獻相關方法[19,21],取S1供試品藥材粉末共6份,按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液,于0,2,6,10,12,24 h,按“2.3.1”項下色譜條件和表3流動相梯度洗脫方法進樣,測得紫丁香苷含量RSD為2.15%,說明樣品溶液在24 h內穩定。

2.3.7 重復性試驗

按照文獻相關方法[19,21],取S1供試品藥材粉末共6份,按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件和表3流動相梯度洗脫方法,連續進樣6次,測得紫丁香苷含量RSD為1.96%,表明該方法重復性符合要求。

2.3.8 加樣回收率試驗

按照文獻相關方法[19,21],取紫丁香苷對照品適量,精密稱定,置50 mL量瓶中,搖勻,即得每1 mL含1.023 3 mg。取S1供試品藥材粉末共6份,每份約0.1 g,精密稱定,按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液,濾液分別精密加入5.0 mL紫丁香苷對照品溶液,用甲醇稀釋至刻度,用0.45 μm微孔濾膜過濾,續濾液分別置于液相小瓶中,測得其平均加樣回收率為102.33%,RSD為2.52%。表明該方法回收率較好。

2.3.9 含量測定

按照文獻相關方法[19,21],精密吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μL,按“2.3.1”項下色譜條件和表3流動相梯度洗脫方法進樣分析,含量測定結果見表4。根據檢測結果,以紫丁香苷含量不低于平均值的70%為最低限度要求計算,初步擬定大接骨丹樹皮藥材紫丁香苷含量不得低于19.39 mg·g-1。

表4 大接骨丹樹皮藥材含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1 薄層色譜條件系統考察

薄層色譜鑒別研究過程中,篩選了提取方法、不同提取溶劑對大接骨丹樹皮藥材提取效果的影響,結合薄層層析效果,選定本試驗研究對象TLC定性分析的提取溶劑與提取方法。同時,重點考察了不同展開溶劑對大接骨丹樹皮藥材定性鑒別的效果,研究發現以本課題組前期研究基礎的三氯甲烷-甲醇-水(體積比15∶4∶0.2)為展開劑[18],TLC定性鑒別效果較佳。

3.2 含量測定檢測波長的選擇

采用Agilent 1260型高效液相色譜儀DAD檢測器,多波長篩選紫丁香苷檢測波長,研究發現,當檢測波長為210 nm時,大接骨丹樹皮藥材中紫丁香苷分離度高、峰型較好,因此,確定大接骨丹樹皮藥材中紫丁香苷含量測定的檢測波長為210 nm。

3.3 檢查項及浸出物

參考文獻[18-19],并依據該藥材所含成分的理化性質,最終確定水分測定法采用烘干法,浸出物測定采用熱浸法且以70%乙醇為溶劑,灰分檢測總灰分。

本試驗對大接骨丹樹皮藥材薄層色譜定性鑒別、水分含有量、總灰分含有量、浸出物含有量、紫丁香苷含量測定方法,進行了較為系統的研究,結果顯示:大接骨丹樹皮藥材中紫丁香苷在0.123 5～1.235 3 mg/mL范圍內,線性關系良好,相關系數r值為0.999 9,紫丁香苷平均加樣回收率為102.33%,RSD為2.52%;6批大接骨丹樹皮藥材水分、總灰分、浸出物含有量分別為8.28%～10.53%,4.84%～7.16%,15.63%～22.45%。試驗可為大接骨丹樹皮藥材的臨床用藥、藥材的質量控制以及質量標準擬定,提供數據參考。