神經調節素1β對氧糖剝奪/復氧誘導PC12細胞損傷的保護作用及其機制

孫珊珊 于曦 翟秋月 于竹芹

(1 山東大學齊魯醫院(青島)神經內科,山東 青島 266035; 2 青島大學醫學部中西醫結合中心; 3 青島大學醫學院松山醫院內科)

隨著世界人口的老齡化,缺血性卒中的發病率逐年增加[1]。目前普遍認為,腦缺血后血液供應恢復對于挽救缺血區受損組織、降低缺血性卒中患者的殘疾率和病死率至關重要。然而,再灌注也會引起一系列細胞應激反應,加重神經血管損傷,導致血-腦屏障破壞和神經細胞死亡,造成腦缺血再灌注損傷[2-4]。據報道,神經調節素1β(NRG1β)在大腦海馬、大腦皮質、梨狀皮質等部位均有表達,可減輕腦卒中后的腦損傷[5-6]。本課題組的前期研究發現,NRG1β可通過調節大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半影區神經細胞的JNK和Cdk5信號轉導通路發揮神經保護作用[7-8]。最新研究表明,缺血半影區神經細胞鐵死亡與腦缺血再灌注損傷密切相關[9-10]。GUAN等[11]指出,香芹酮可通過增強缺血半影區神經細胞谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的表達來抑制鐵死亡,從而修復缺血再灌注損傷引起的海馬神經元損傷。因此,抑制鐵死亡可能是干預腦缺血再灌注損傷的潛在治療方法。基于上述研究,本研究將構建PC12細胞氧糖剝奪/復氧(OGD/R)模型,旨在探討NRG1β對OGD/R誘導的PC12細胞損傷的保護作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PC12細胞系購自上海iCell公司;CCK-8試劑盒、ROS熒光檢測試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒、氧化型谷胱甘肽(GSSG)試劑盒、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司,BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司,β-actin抗體購自武漢Proteintech公司,GPX4抗體購買于成都正能生物有限公司。

1.2 OGD/R模型構建及細胞分組

將PC12細胞接種于96孔板中,待匯合度達到70%～80%時將原培養基(改良型RPMI培養液+體積分數0.10的馬血清+體積分數0.05的胎牛血清+10 g/L雙抗)更換為無糖RPMI-1640培養液,轉移至厭氧盒中(含體積分數0.94 N2、體積分數0.01 O2和體積分數0.05 CO2)繼續培養6 h完成氧糖剝奪后,更換為原培養基置于培養箱復氧(O2體積分數0.21)培養48 h。然后將PC12細胞分為對照組、模型組和干預組,每組均設置2個復孔,實驗重復3次。對照組使用原培養基培養72 h,模型組在復氧培養結束后,更換為原培養基處理48 h,干預組同樣更換為原培養基并且加入NRG1β(終濃度10 nmol/L)處理48 h。

1.3 各組細胞形態觀察及活力檢測

細胞OGD/R 48 h后,將孔板直接置于倒置顯微鏡下,觀察各組細胞的細胞形態。各組細胞處理結束后,以PBS洗滌孔板中的細胞2次,然后每孔中按照10∶1加入細胞培養液和CCK8檢測液,置于培養箱37 ℃下孵育90 min。使用酶標儀測定波長450 nm處各孔的吸光度值,計算各組細胞的細胞活力。細胞活力=(實驗組吸光度均值-空白組吸光度均值)/(對照組吸光度均值-空白組吸光度均值)×100%。

1.4 細胞中活性氧(ROS)水平檢測

各組細胞處理結束后,以PBS洗滌細胞2次,然后每孔按DCFH-DA和PBS 1∶1 000比例加入稀釋好的DCFH-DA工作液(終濃度為10 μmol/L)100 μL,置于培養箱37 ℃下孵育20 min后,用無血清細胞培養液洗滌細胞3次,設置酶標儀(激發波長488 nm,發射波長525 nm,檢測波長450 nm),檢測各組細胞的熒光強度,以熒光強度來表示細胞中ROS水平。

1.5 細胞中MDA水平的檢測和GSH/GSSG吸光度比值的計算

各組細胞處理結束后,首先加適量RIPA充分裂解細胞,然后按照試劑盒說明書的要求,分別配置MDA和GSH/GSSG檢測所需試劑,并按照要求依次加入相關試劑。反應完成后,以酶標儀分別測定532 nm(MDA)和560 nm(GSH/GSSG)波長處的吸光度值,并繪制相應的標準曲線,計算各組細胞中MDA的相對含量和GSH/GSSG 吸光度比值。

1.6 透射電鏡觀察各組細胞的超微結構

各組細胞處理結束后,將96孔板置于25 g/L的戊二醛中4 ℃下固定過夜,再經10 g/L的鋨酸處理2 h,以PBS洗滌細胞3次,每次20 min;梯度乙醇脫水后,置于丙酮中滲透,于包埋板中完成包埋。采用超薄切片機將包埋烘干好的樣品以50 nm厚切片后置于銅網上,硝酸鉛和醋酸鈾染色,透射電子顯微鏡下觀察各組細胞的超微結構。

1.7 Western blot方法檢測細胞中GPX4蛋白相對表達水平

各組細胞處理結束后,加適量RIPA裂解液充分裂解細胞,加入5×SDS煮沸后變性處理,BCA法檢測蛋白的濃度。根據配膠試劑盒說明書配制10%凝膠,加入10～20 μL各組細胞提取的蛋白樣品,100 V恒壓電泳后,120 V恒壓轉膜;然后依次用脫脂奶粉進行封閉和β-actin及GPX4一抗孵育,次日,以辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗孵育2 h后顯影。應用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以同一標本的β-actin為內參照,目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值即為目的蛋白相對表達量,試驗重復3次,結果取均值。

1.8 統計分析

2 結 果

2.1 3組細胞形態及活力比較

OGD/R 48 h后,倒置顯微鏡下觀察發現,對照組PC12細胞呈圓形或不規則形貼壁生長,細胞透亮,生長速度較快(圖1A);模型組細胞生長緩慢,可見部分死亡后漂浮的細胞(圖1B);與模型組相比,干預組細胞生長狀態和速度均有改善(圖1C)。對照組、模型組和干預組細胞活力分別為91.09±1.44、62.18±2.49、71.69±2.35,3組比較差異有顯著性(F=48.031,P<0.01);與對照組相比,模型組細胞活力顯著降低(t=25.76,P<0.01);與模型組相比,干預組細胞活力顯著升高(t=8.03,P<0.05)。

a:對照組,B:模型組,C:干預組,100倍

2.2 3組細胞中ROS、MDA水平及GSH/GSSG 吸光度比值比較

熒光顯微鏡下觀察顯示,對照組細胞中綠色熒光較弱(圖2A),模型組細胞中綠色熒光較亮(圖2B),干預組細胞中綠色熒光變暗(圖2C)。酶標儀檢測結果顯示,3組PC12細胞中ROS、MDA水平及GSH/GSSG吸光度比值比較具有顯著差異(F=7.118～58.724,P<0.05);模型組細胞中ROS水平較對照組顯著升高(t=12.43,P<0.01),干預組細胞的ROS水平較模型組顯著降低(t=10.34,P<0.01),模型組細胞GSH/GSSG吸光度比值較對照組顯著降低(t=9.17,P<0.01),干預組較模型組顯著升高(t=15.71,P<0.01);模型組細胞中MDA水平相較于對照組顯著升高(t=29.46,P<0.01),干預組較模型組則顯著降低(t=2.96,P<0.05)。見表1。

a:對照組,B:模型組,C:干預組,DCFH-DA熒光染色,200倍

表1 3組細胞中ROS、MDA水平及GSH/GSSG吸光度比值比較

2.3 3組細胞中線粒體損傷情況比較

透射電鏡觀察結果顯示,對照組細胞中線粒體形態規則,結構完整,線粒體嵴排列有序(圖3A);和對照組及干預組相比,模型組線粒體損傷較重,表現為線粒體內膜破裂,線粒體嵴消失(圖3B);與模型組相比,干預組線粒體損傷得到一定改善(圖3C)。

A:對照組,B:模型組,C:干預組;鉛染色,上排放大倍數12 000倍,下排為上排黃色框中局部區域的放大(50 000倍);圖中黑色箭頭指示正常線粒體,紅色箭頭指示損傷線粒體

2.4 3組細胞中GPX4蛋白相對表達水平比較

Western blot方法檢測顯示,對照組、模型組和干預組細胞中GPX4蛋白的相對表達水平分別為1.58±0.02、0.75±0.07、1.09±0.09,3組比較差異具有顯著性(F=37.498,P<0.05);模型組細胞中GPX4蛋白的相對表達水平較對照組顯著降低(t=23.06,P<0.01),干預組細胞中GPX4相對表達水平較模型組顯著升高(t=6.07,P<0.05)。見圖4。

圖4 3組細胞中GPX4蛋白相對表達水平比較

3 討 論

既往研究顯示,腦缺血再灌注損傷是一個復雜病理生理過程,是興奮性毒性、鈣失調、氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡等相互作用的結果[12-13]。神經保護劑治療可能是一種潛在的干預腦缺血再灌注損傷的策略。

NRG屬表皮生長因子家族,通過激活ErbBs蛋白的受體絡氨酸激酶進行一系列信號轉導,從而發揮生物學作用。根據編碼基因的不同,NRG可以分為NRG1～NRG4 4種同分異構體[14]。NRG1β/ErbB4信號傳導與神經元遷移、軸突引導、神經膠質細胞發育、軸突髓鞘化、發育中的突觸形成以及成人大腦突觸的可塑性有關[15]。NRG1β可以保護神經元免受缺血性損傷,并且NRG1β通過抑制促炎反應和PI3K/Akt信號通路發揮神經保護作用[16]。本項目組前期的研究表明,在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中,NRG1β能夠通過抑制缺血半影區神經細胞Cdk5信號通路,降低神經元凋亡,減小腦梗死體積,改善大鼠的神經行為[17]。

鐵死亡是一種非凋亡形式的細胞死亡,其特征是細胞內鐵和脂質ROS積累。鐵死亡的細胞形態學特征為線粒體萎縮,線粒體嵴減少,內膜壓縮,外膜破裂及細胞核完整,其發生與鐵、氨基酸和過氧化脂質的代謝過程有關[18]。大量研究證明,神經細胞鐵死亡與缺血性腦卒中的病理生理過程密切相關,抑制缺血半影區神經細胞鐵死亡可以減輕腦卒中后繼發性腦損傷,提示鐵死亡通路可能是腦卒中的潛在治療靶點[19]。此外,LAN等[20]研究發現,中草藥腦泰方化合物也可以通過調節轉鐵蛋白受體1/二價金屬轉運蛋白1以及溶質載體家族7成員11/GPX4通路,減少缺血性卒中后的神經元鐵死亡。值得注意的是,蒲公英醇通過誘導Nrf2核積累和鐵死亡關鍵蛋白GPX4表達,可顯著抑制OGD/R誘導的海馬神經元中ROS和MDA的產生。由此推測,蒲公英醇可能是通過調節腦缺血再灌注損傷神經元中Nrf2信號通路而使其免受氧化應激和發生鐵死亡[19]。綜上所述,神經細胞鐵死亡可能是腦缺血再灌注損傷的重要機制,但NRG1β是否通過調控鐵死亡發揮腦細胞保護作用尚不清楚。

本研究結果顯示,與對照組相比,模型組細胞活力下降,干預組細胞活力得到改善,這提示NRG1β的干預治療可以改善PC12細胞損傷;同時,熒光顯微鏡下觀察和酶標儀檢測結果顯示,與模型組比較,經NRG1β處理后,PC12細胞的綠色熒光強度減弱,細胞中MDA水平顯著下降,GSH/GSSG吸光度比值顯著升高。由于細胞中ROS、MDA水平和GSH/GSSG吸光度比值與細胞鐵死亡密切相關,因此干預組在一定程度上改善了受損PC12細胞的鐵死亡狀況。線粒體損傷是細胞鐵死亡的關鍵形態學特征,本研究又進一步對各組PC12細胞線粒體損傷情況進行檢測,結果顯示,干預組和模型組相比,線粒體損傷程度得到改善。本研究進一步檢測了PC12細胞中抑制細胞鐵死亡的關鍵蛋白GPX4的表達水平,結果顯示,干預組GPX4的相對表達水平較模型組顯著升高,從而進一步提示NRG1β干預治療可改善受損PC12細胞的鐵死亡程度[21]。

綜上所述,本研究結果顯示,NRG1β可以降低OGD/R模型PC12細胞的ROS、MDA水平以及GSH/GSSG吸光度比值,改善線粒體超微結構,上調細胞鐵死亡關鍵蛋白GPX4的表達,表明NRG1β干預治療可能是通過影響受損PC12細胞的鐵死亡關鍵蛋白GPX4的表達而發揮細胞保護作用的,本研究結果為探究NRG1β治療腦缺血再灌注損傷提供了實驗依據。

作者聲明：于竹芹、孫珊珊、翟秋月參與了研究設計;孫珊珊、于曦、翟秋月、于竹芹參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文,且均聲明不存在利益沖突。