YAP1與RNA分子m6A修飾配合對胃癌化療敏感性的影響

鄭黎明, 甄生華, 黃祖義, 歐陽玉律, 戴 峰

(湖北省監利市人民醫院腫瘤內科, 湖北 監利 433300)

胃癌(Gastric cancer,GC)是全球癌癥相關死亡的主要原因,盡管有各種治療策略,但患者預后仍然很差,5年生存率僅為20～25%[1]。因此,有效識別和開發用于診斷和治療GC患者的新分子方法仍然是迫切的臨床需求。N6-甲基腺苷(N6-Methyladenosine,m6A)修飾是最普遍的mRNA修飾之一,會影響mRNA的轉錄、穩定和翻譯[2]。m6A甲基轉移酶復合物的核心分子,包括甲基轉移酶樣3(methyltransferase-like 3,METTL3)、甲基轉移酶樣14和WT1相關蛋白,介導甲基化修飾[3]。最近,一些研究表明,METTL3功能失調會導致人類癌癥的發生、發展和耐藥性[4]。然而,METTL3介導的耐藥性生物學分子機制需要在GC方面進一步探索。一組含有YTH結構域的蛋白質(YTHDF)已被確定為m6A“閱讀器”,可識別m6A標記并介導m6A功能[5]。YTHDF具有許多重要的生物學功能,尤其對Hippo信號通路的轉錄調控方面[6]。最近研究發現,METTL3啟動的m6A mRNA甲基化通過將YTHDF1/3招募到翻譯起始復合物來促進Yes相關蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1) mRNA的翻譯,YAP1表達和活性的增加可誘導NSCLC耐藥和轉移[6]。然而,METTL3是否通過促進m6A依賴的YAP1翻譯誘導GC對順鉑的耐藥性仍有待進一步闡明。在本研究中,我們評估了順鉑耐藥GC細胞中METTL3表達與YAP1 mRNA的m6A修飾之間的關系,并闡明了這種關系是否與順鉑耐藥性有關。

1 材料與方法

1.1細胞:順鉑耐藥的AGS/DDP及其親本順鉑敏感的AGS購自美國ATCC,將它們接種在含10%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM,美國Gibco公司)中生長。

1.2質粒和小干擾RNA構建:人METTL3 siRNA(si-METTL3)、人YAP1 siRNA(si-YAP1)及對照siRNA(si-NC)由廣州Riobobio公司構建。使用Lipofectamine 3000試劑將質粒轉染到細胞中。在轉染后24h,收獲細胞并用于實驗。使用Phusion高保真DNA聚合酶(美國Thermo Fisher Scientific公司)從HEK293細胞制備的cDNA中PCR擴增YAP1的整個序列,并克隆到pcDNA3.1-的HindⅢ/XbaI位點myc-HisA載體。為了設計翻譯報告構建體,YAP1的推定m6A修飾位點從HEK293 cDNA進行PCR擴增,并克隆到海腎熒光素酶基因的3-UTR的XhoI位點psiCHECK3載體。以上質粒載體的構建和合成均由上海裕森生物科技有限公司完成。

1.3蛋白質免疫印跡:對于免疫印跡,收獲細胞,在磷酸鹽緩沖液中洗滌,并在含有150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.25%脫氧膽酸鈉、1mM乙二胺四乙酸、1% NP40、1mM NaF、0.2mM 苯甲基磺酰氟、0.1mM原釩酸鈉和蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物中提取蛋白。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質樣品(10～30μg)并印跡到聚偏二氟乙烯膜上;使用指定的抗體探測免疫印跡。使用Super Signal West Femto化學發光底物(美國Thermo Fisher Scientific公司)使免疫印跡可視化。用Image J軟件對條帶強度進行量化。所有印跡一式三份進行。使用的抗體包括針對YAP1 (1∶1000)、METTL3 (1∶1000)、METTL14 (1∶1000)、WTAP (1∶1,000)和FTO (1∶1000)購自美國Cell Signaling Technology公司。針對抗β-肌動蛋白 (1∶10000)和抗FLAG (1∶5000) 抗體購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.4Poly(A) RNA斑點印跡:使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)從AGS和AGS/DDP細胞中分離總RNA。然后,使用Oligotex mRNA mini kit(德國Qiagen公司)從總RNA中純化poly(A) RNA。使用UV交聯劑將Poly(A) RNA (100ng)交聯到Hybond N+膜上。使用抗m6A抗體(1∶1000,德國Synaptic Systems公司)探測膜,并使用Super Signal West Femto化學發光底物(美國Thermo Fisher Scientific公司)對印跡進行可視化。

1.5熒光素酶測定:使用雙熒光素酶報告分析系統(美國Promega公司)測量用psiCHECK3載體轉染的AGS和AGS/DDP細胞裂解物中的海腎熒光素酶活性。該載體產生的螢火蟲熒光素酶活性用于標準化轉染效率的結果。

1.6Tunel檢測:通過Tunel染色評估細胞凋亡誘導,并使用原位細胞凋亡檢測試劑盒(瑞士Roche Life Science公司)進行檢測。將2 × 104個細胞接種到置于24孔板內的蓋玻片上并孵育24h。使用Lipofectamine 3000試劑將指定的質粒轉染細胞24h。然后用順鉑(10μg/mL)處理細胞24h。用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞并使用Cytofix/Cytoperm試劑在4 ℃下固定20min。細胞用50μL Tunel溶液在37 ℃染色1h,然后用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌2次。使用配備有FITC濾光片的Axiovert 200M熒光顯微鏡檢測 DNA片段化。

1.7小鼠異種移植模型:雄性BALB/c裸鼠(6周大)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,并飼養在光照和溫度控制室的籠子中。將用指定的敲除質粒轉染的AGS或AGS/DDP細胞(2×106個細胞/100μL/小鼠)皮下注射到小鼠側腹。5天后,將小鼠分成指定的組,每周2次腹腔注射二甲亞砜(n = 8)或順鉑(5mg/kg,n = 12),連續6周。給藥6周后,對小鼠實施安樂死,計算所有組的腫瘤重量。

1.8統計分析:使用Prism 8進行統計分析。雙尾學生t檢驗用于評估兩個獨立組之間的比較。單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗用于多組比較分析。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1AGS/DDP細胞中METTL3表達上調:與AGS細胞相比,AGS/DDP中的METTL3、METTL14和WTAP表達顯著上調,而FTO表達保持相對不變(圖1A、B)。然后通過使用m6A特異性抗體對poly(A) RNA進行斑點印跡來確定m6A修飾的程度,結果顯示AGS/DDP與AGS細胞相比顯著上調(圖1C)。AGS/DDP細胞中的METTL3敲除消除了mRNA的m6A修飾(圖1D)。總之,這些結果表明METTL3表達在順鉑抗性GC細胞中增加,導致mRNA的m6A修飾增強。

圖1 AGS/DDP細胞中METTL3表達上調

2.2METTL3提高AGS/DDP細胞中YAP1的翻譯效率:我們接下來評估了在AGS/DDP細胞中觀察到的m6A YAP1水平升高是否與YAP1翻譯增強有關。與親本AGS細胞相比,AGS/DDP細胞中YAP1表達的免疫印跡顯示出顯著上調(圖2A)。為了檢查由METTL3介導的m6A修飾是否負責增強AGS/DDP細胞中YAP1 mRNA的翻譯,通過將推定的源自YAP1的m6A修飾位點插入熒光素酶基因的3'-UTR區域來設計翻譯報告基因構建體(圖2B)。細胞裂解物中熒光素酶活性的分析顯示,與AGS細胞相比,AGS/DDP中攜帶野生型YAP1 m6A基序的熒光素酶報告基因的翻譯在其3'-UTR中增加。相比之下,YAP1 m6A基序的突變減少了熒光素酶報告基因的翻譯,表明YAP1的m6A修飾增加增強了其在AGS/DDP細胞中的翻譯(圖2C)。通過AGS/DDP細胞中的METTL3敲除進一步檢查了調節YAP1翻譯的機制,這導致攜帶YAP1 m6A基序的熒光素酶報告基因的翻譯減少(圖2D)。總之,這些結果表明m6A修飾對于增強AGS/DDP細胞中YAP1的翻譯至關重要。

圖2 METTL3提高AGS/DDP細胞中YAP1的翻譯效率

2.3METTL3提高AGS/DDP細胞中YAP1的蛋白質水平:接下來,我們檢查了METTL3調節的YAP1翻譯效率是否影響其在AGS和AGS/DDP細胞中的蛋白質水平。AGS細胞中METTL3的過表達顯著增加了YAP1蛋白表達,而AGS/DDP細胞中的METTL3敲除降低了YAP1表達(圖3A、B)。為了比較AGS和AGS/DDP細胞之間YAP1的蛋白質合成速率(翻譯效率),我們通過環亮氨酸處理抑制m6A修飾,結果顯示AGS/DDP細胞中YAP1蛋白水平以劑量依賴方式降低(圖3C)。為了檢查環亮氨酸是否通過減少m6A修飾來降低YAP1表達,我們用環亮氨酸處理過表達METTL3的AGS細胞,結果顯示METTL3誘導的YAP1增強表達在環亮氨酸處理后降低,進一步表明 METTL3通過m6A修飾mRNA增加YAP1表達(圖3D)。

圖3 METTL3提高AGS/DDP細胞中YAP1的水平

2.4METTL3促進的YAP1表達對順鉑耐藥的AGS/DDP細胞凋亡影響:Tunel染色檢查DNA的凋亡片段顯示,與順鉑處理的AGS/DDP細胞相比,順鉑處理的METTL3或YAP1敲除的AGS/DDP細胞中DNA片段化明顯增加(圖4)。

圖4 METTL3促進的YAP1表達對順鉑耐藥的AGS/DDP細胞凋亡影響

圖5 METTL3的抑制通過降低YAP1表達來恢復體內順鉑的敏感性

2.5METTL3的抑制通過降低YAP1表達來恢復體內順鉑的敏感性:使用異種移植模型研究METTL3對體內順鉑抗性的影響。將用si-NC或si-METTL3轉染的AGS/DDP細胞皮下注射到BALB/c裸鼠的側腹。與DMSO處理相比,順鉑在AGS小鼠中顯著減少腫瘤重量,但在AGS/DDP小鼠中沒有變化(圖5A)。與皮下注射si-NC轉染的AGS/DDP小鼠相比,順鉑顯著降低了si-METTL3轉染的AGS/DDP小鼠的腫瘤重量(圖5A)。此外,METTL3敲除顯著降低了小鼠腫瘤中的m6A水平和YAP1 蛋白水平(圖5B-C)。這些結果表明,敲除METTL3通過降低YAP1蛋白表達使AGS/DDP細胞對順鉑敏感,從而抑制GC中致瘤性。

3 討 論

許多化療藥物被證實在GC治療中有效,基于順鉑的方案已在臨床上廣泛使用[7]。研究發現,順鉑在化療開始時表現出80%的高反應率;然而,大多數患者的腫瘤復發發生在6個月內[8]。研究表明,GC細胞中YAP1蛋白水平上調,這在順鉑耐藥中起重要作用[9]。然而,對于順鉑耐藥腫瘤中YAP1上調的機制仍然知之甚少。在本研究中,我們將METTL3鑒定為順鉑耐藥GC細胞中YAP1表達的正調節因子。

RNA甲基轉移酶METTL3在mRNA的共有“GGAC”基序內催化m6A的形成[10]。盡管mRNA中的m6A修飾已被認可近50年,但這些修飾的分布及其在生理學和疾病中的作用直到最近才被闡明[10]。m6A是mRNA中最豐富的內部化學修飾[11]。值得注意的是,METTL3表達在幾種腫瘤中上調。在這里,我們發現METTL3表達在順鉑抗性GC細胞系中增加,而m6A去甲基化酶FTO的表達沒有改變,并且由METTL3介導的mRNA的全局m6A修飾也在順鉑抗性GC細胞中增加。最近的研究表明,m6A促進特定mRNA的翻譯以誘導癌癥的耐藥性[12]。YAP1 mRNA被報道含有m6A修飾[5]。我們假設順鉑抗性GC細胞中METTL3表達和YAP1 mRNA m6A修飾的升高可能促進YAP1的翻譯。為了闡明潛在機制,我們使用了基于熒光素酶的翻譯報告基因對其中關系進行探索,結果表明由METTL3介導的m6A修飾增加促進了YAP1在順鉑抗性細胞中的翻譯效率,進一步證實了增加的YAP1蛋白源自增強的mRNA翻譯。

報道表明,YAP1表達的增加促進了睪丸腫瘤和肝癌對順鉑的內在耐藥性[13-14]。在胃癌中,研究發現,YAP1的上調增強GC細胞的順鉑抗性和促進了裸鼠異種移植物腫瘤的生長、順鉑耐藥性[15]。與先前研究一致,在這里,我們進一步證明了順鉑抗性胃癌細胞中的METTL3敲除可降低YAP1表達,從而恢復了順鉑誘導的順鉑抗性胃癌細胞凋亡,增加了胃癌細胞中順鉑的敏感性。此外,我們在小鼠異種移植模型中的發現進一步支持了敲除METTL3通過降低YAP1蛋白表達使AGS/DDP細胞對順鉑敏感,從而抑制胃癌中致瘤性。總之,這些數據表明,由METTL3表達增加介導的YAP1翻譯增強促進了胃癌對順鉑的耐藥性。由于METTL3調節幾種mRNA的m6A修飾,未來的研究應該分析來自順鉑敏感和耐藥腫瘤樣本的m6A修飾轉錄組,以確定METTL3是否作為在順鉑耐藥中最關鍵的靶標。此外,盡管已經描述了許多介導METTL3功能的下游途徑,但對調節METTL3的上游機制知之甚少。在未來,我們將嘗試探索METTL3的上游信號通路,并強調METTL3相關通路為治療靶點。

總之,本研究揭示了METTL3誘導的YAP1表達上調作為GC中順鉑耐藥的新機制,并建議METTL3作為化療的新靶點。值得注意的是,最近描述了一種有效的METTL3抑制劑[16]。盡管需要利用METTL3的藥理學抑制劑進行進一步研究,以提供有關METTL3抑制在順鉑耐藥GC中的臨床療效的信息,但本研究結果強調了抑制METTL3功能以恢復GC患者對順鉑敏感性的可能性。