MiR-155對HuR的調控與結腸癌細胞的轉移機制研究

張小風, 趙建鋒, 呂 洋, 范金強, 強 勇

(湖北省荊門市人民醫院/荊楚理工學院附屬中心醫院, 湖北 荊門 448000)

結直腸癌(CRC)是全球第三大常見癌癥,被認為是最常見的癌癥之一,對人類健康影響很大,盡管在過去幾十年中,CRC的治療取得一些進展,但CRC患者的總生存率并沒有預期的變化[1]。CRC的發展涉及多步驟,包括遺傳和表觀遺傳變化,這導致癌細胞中癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活[2]。MicroRNA(miRNA)是非編碼RNA分子,通過與相應mRNA靶標的39個非翻譯區域結合來發揮其功能,大約三分之一的人類基因被認為受miRNA調控,這表明miRNA在生理和病理過程中具有關鍵作用[3]。大量研究表明,miRNA與人類腫瘤有關,異常的miRNA表達可導致相應的異常蛋白表達,這可能導致獲得惡性特征[3]。因此,miRNA的功能應該是腫瘤抑制因子或癌基因。最近,研究顯示miR-155在CRC腫瘤發生和腫瘤進展中起著至關重要的作用[4]。miR-155場缺損的檢測和監測可能對預防和治療具有微衛星不穩定性的炎癥性腸病相關CRC產生影響。此外,miR-155的表達與人結直腸癌中MLH1或MSH2蛋白的表達之間存在負相關關系[5]。研究證實miR-155過表達可以下調MLH1,MSH2和MSH6的表達,從而導致腫瘤發生[6]。然而,miR-155對CRC增殖和侵襲轉移的影響遠未得到充分了解。有研究顯示HuR與CRC的惡性表型密切相關,主要是通過其靶mRNA的穩定[7]。相關研究顯示通過敲低circPPFIA1s增加的轉移潛力通過HuR沉默減弱,可阻斷結直腸癌中HuR的致癌作用[8]。本研究主要探究miR-155通過對HuR的調控參與結腸癌細胞轉移的機制研究。

1 材料與方法

1.1細胞培養:HCT-116結腸癌細胞系均從中國科學院細胞庫類型培養收集中購買,并在含有10%胎牛血清(FBS;Gibco;賽默飛世爾科學公司)rmi-1640培養基中培養(Gibco;賽默飛世爾科學公司)維持在37℃和5%CO2。MCF-7和H184B5F5/M10細胞在MEM-α中維持,具有相同的補充劑和培養條件。

1.2轉染:miR-155模擬物(5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3′)和抑制劑(5′-AAUUACGAUUAGCACUAUCCCCA-3′)或其相應的陰性對照從Bioomics Biotech購買。收獲細胞并以1×105細胞/孔的密度接種在6孔板中。孵育24h后,將細胞培養基改為無血清培養基,額外培養6h后,根據制造商的協議使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen;賽默飛世爾科技公司)進行轉染。

1.3逆轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR):在轉染后48h,收集每組細胞,使用TRIzol試劑(Invitrogen)對RNA進行逆轉錄,并通過RT-qPCR(SYBR Green方法)和miR-155檢測試劑盒(Biomics Biotech)檢測miR-155的水平。使用Moloney小鼠白血病病毒逆轉錄酶(Promega Corp)和隨機引物將總RNA逆轉錄為互補(c)DNA,以cDNA為模板,采用RT-qPCR方法檢測HuR mRNA水平,引物如下:HuR正向,5'-GGACCAGTGAGTTGGGAGTTATTACT-3 ',反向,HuR,5'-GGCAAGACTTCACTGTGAAGTCA-3';GAPDH正向,5'-AAGGTCGGAGTCACCGGATT-3',反向,5' -CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3',PCR混合物包含:2μL cDNA、1μL正向引物、1μL反向引物、10μL 2X SYBR混合物和最多20μL的ddH2O2,熱循環條件為:95℃ 10min;95℃為10s,62℃為20s,72℃為30s,40個周期。將HuR的mRNA水平歸一化為GAPDH,使用2-ΔΔCq方法計算HuR的相對mRNA水平。

1.4傷口愈合試驗:將細胞接種在6孔板(1×106細胞/孔)并在12孔板中生長至80%匯合,在細胞單層中產生兩個線性劃痕,每個孔中具有200μL微量移液管尖端,之后在無血清培養基中處理細胞并允許遷移24h。在AxioVert 200M熒光顯微鏡下捕獲傷口區域的圖像(放大倍率,×100)在0h和24h。遷移根據以下公式計算:細胞遷移率=(培養后0h劃痕寬度-劃痕寬度)/0h劃痕寬度。

1.5MTT測定:將細胞接種在96孔板中,每孔中有6000個細胞,用miR-155模擬物,模擬物的陰性對照,miR-155抑制劑或抑制劑的陰性對照轉染細胞。在轉染后0、24、48、72和96h,向每個孔中加入5mg/mL MTT,再孵育4h后,除去上清液,向每個孔中加入200μL二甲基亞砜,使用酶標儀在490nm處測量吸光度。

1.6菌落形成測定:用miR-155模擬物、miR-155抑制劑或其陰性對照轉染后,將200個細胞在6孔板中孵育,并在含有37℃,5%CO2的培養箱中培養時,孵育后7天,將細胞用結晶紫染色30min,并用PBS洗滌后計數菌落數。

1.7細胞周期分析:用miR-155模擬物、miR-155抑制劑或其相應的陰性對照轉染后收獲細胞,并在4℃下固定在冰冷的70%乙醇中過夜,用PBS洗滌細胞,并用細胞周期檢測試劑盒在黑暗中染色30min,后用FACScalibur流式細胞儀(BD生物科學)分析細胞周期分布。

1.8細胞凋亡測定:根據制造商的方案,使用膜聯蛋白V-熒光素異硫氰酸酯(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(KeyGEN生物技術,中國江蘇)檢測細胞凋亡,用miR-155模擬物,miR-155抑制劑或其相應的陰性對照轉染后,用PBS洗滌細胞并重新懸浮在500μL結合緩沖液中,加入5μL膜聯蛋白V-FITC和5μL PI后,將細胞懸液在黑暗中孵育15min,用FACScalibur流式細胞儀分析細胞。

1.9蛋白質印跡分析:將總細胞樣品用冰冷的PBS洗滌兩次,并在裂解緩沖液中孵育10min。使用BCA蛋白質測定試劑盒(中國上海Sangon Biotech)測定蛋白質濃度。使用SDS-PAGE分離等量的樣品蛋白(20μg)并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶試劑封閉膜,后與一抗在4℃下孵育12h。通過與辣根過氧化物酶偶聯二抗(中國上海Sangon Biotech)孵育來檢測蛋白質條帶,并用增強型化學發光試劑(中國江蘇Beyotime)可視化。

1.10熒光素酶報告基因測定:采用熒光素酶報告基因檢測miR-155是否直接與HuR的3′UTR結合,正如TargetScan(http://www.targetscan.org/)預測的那樣,含有野生型(WT)或突變型(MUT)miR-155結合位點或缺乏miR-155結合位點(DEL)的HuR mRNA片段分別克隆到pMIR-REPORT熒光素酶報告載體中。將HCT-116細胞接種到24孔板中,將0.2μg熒光素酶報告質粒WT、MUT或DEL與0.2μg β-半乳糖苷酶對照質粒(Ambion)一同接種,使用Lipofectamine 2000試劑將20 pmolmiR-155模擬物或陰性模擬物對照共轉染到HCT-116細胞中,在轉染后48h,根據制造商的方案使用熒光素酶測定系統(Promega Corp.)測量熒光素酶活性。

2 結 果

2.1miR-155的上調對結腸癌細胞的增殖和細胞周期作用:用miR-155模擬物轉染后,通過RT-qPCR檢測miR-155的水平,結果表明與對照組比較,用miR-155模擬物轉染后,miR-155水平升高;用miR-155模擬物轉染后,通過MTT測定檢測結腸癌細胞的活力。結果表明,轉染miR-155模擬物72h后細胞活力增加。菌落形成試驗結果顯示,miR-155模擬物轉染后,菌落數為90±2.6,顯著高于模擬物陰性對照轉染的細胞(60.6±5.1),證明miR-155模擬物促進了結腸癌細胞的增殖。用miR-155模擬物或其相應的陰性對照轉染后檢測細胞周期分布,流式細胞術分析顯示,用miR-155模擬物轉染后,G1期細胞由67.83%降至54.41%,但S期細胞由23.78%增至36.16%,結果表明miR-155模擬物增加了S期細胞的百分比,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1A-D。

圖1 miR-155的上調對結腸癌細胞的增殖和細胞周期作用

圖2 miR-155的上調對結腸癌細胞的遷移和凋亡作用

2.2miR-155的上調對結腸癌細胞的遷移和凋亡作用:細胞凋亡測定,轉染miR-155模擬物陰性對照后,早期凋亡率為13.83±0.76%,晚期凋亡率為2.51±0.31%,用miR-155模擬物轉染后,早期凋亡率降至3.72±0.59%,晚期凋亡率降至1.65±0.14%,結果表明miR-155模擬物抑制結腸癌細胞的凋亡,使用傷口愈合測定法評估轉染后結腸癌細胞的遷移能力,轉染有模擬物陰性對照的細胞的遷移率為0.148±0.015,而轉染miR-155模擬物的細胞的遷移率為0.265±0.18,結果表明miR-155模擬物促進了結腸癌細胞的遷移,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2A-D。

2.3miR-155的下調對結腸癌細胞的增殖和細胞周期作用:用miR-155抑制劑轉染后,通過RT-qPCR檢測miR-155的水平,結果表明與陰性對照轉染細胞比較,用miR-155抑制劑轉染后miR-155降低;檢測結腸癌細胞的細胞活力和集落形成能力。結果表明,與轉染抑制劑陰性對照的細胞相比,miR-155抑制劑轉染后結腸癌細胞的活力受到抑制,菌落數量從73.67±4.16減少到48.33±3.05;用miR-155抑制劑或其相應的陰性對照轉染后檢測細胞周期分布,結果表明轉染miR-155抑制劑后,G1期細胞百分比從57.97%增加到72.54%,但S期細胞百分比從30.81%下降到17.07%,表明miR-155抑制劑增加了G1期細胞的百分比,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3A-D。

圖3 miR-155的下調對結腸癌細胞的增殖和細胞周期作用

圖4 miR-155的下調對結腸癌細胞的遷移和凋亡作用

2.4miR-155的下調對結腸癌細胞的遷移和凋亡作用:用miR-155抑制劑或其相應的陰性對照轉染后進行細胞凋亡測定,轉染miR-155抑制劑陰性對照后,早期凋亡率為(6.49±0.90)%,晚期凋亡率為(2.88±0.15)%,而miR-155抑制劑轉染后,早期凋亡率提高至(21.03±1.17)%,晚期凋亡率提高至(5.92±0.29)%,結果表明miR-155抑制劑誘導結腸癌細胞凋亡,用miR-155抑制劑轉染后檢測結腸癌細胞的遷移能力,轉染抑制劑陰性對照的細胞遷移率為0.178±0.018,而轉染miR-155抑制劑的細胞遷移率為0.076±0.025,傷口愈合試驗表明miR-155抑制劑減少了結腸癌細胞的遷移,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4A-D。

2.5miR-155-5p與HuR的作用:通過RT-qPCR和蛋白質印跡分析檢測HuR水平,RT-qPCR結果表明,用miR-155抑制劑轉染后HuR的mRNA水平降至(25.33±3.05)%,轉染miR-155模擬物后,HuR的mRNA水平升高至陰性對照組(3.51±0.27)倍。用miR-155抑制劑轉染后HuR蛋白水平降至(14±5.29)%,轉染miR-155模擬物后HuR蛋白水平升高至陰性對照組(1.69±0.27)倍,差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明,HuR受miR-155調控,為了確定HuR是否是miR-155的直接靶標,進行了熒光素酶報告基因測定。熒光素酶報告基因測定,與WT加miR-155模擬物共轉染導致相對熒光素酶活性顯著降低至WT加模擬物陰性對照組的(61±17)%,轉染MUT加miR-155模擬物的細胞的相對熒光素酶活性與MUT加模擬物陰性對照之間沒有顯著差異,轉染DEL加miR-155模擬物的細胞和DEL加模擬物陰性對照的細胞的相對熒光素酶活性之間也沒有顯著差異,這些結果表明,miR-155與HuR的3′UTR結合,并且HuR是miR-155的直接靶標。見圖5A-D。

圖5 miR-155-5p與HuR的作用

3 討 論

目前的研究表明結直腸癌中miRNA的不同表達水平可參與結直腸癌的發生和進展,并可作為結直腸癌診斷和預后的生物標志物[3]。在本研究中,探討了miR-155對結腸癌細胞的影響。發現miR-155的上調可促進結腸癌細胞的增殖和遷移,同時促進細胞周期進程并抑制細胞凋亡。相反,發現miR-155的下調可抑制結腸癌細胞的增殖和遷移,引起細胞周期停滯并誘導細胞凋亡。進一步的研究表明,HuR是miR-155的直接靶標,miR-155可能通過它對增殖、遷移、細胞周期和細胞凋亡產生影響。

在許多癌癥中,miR-155促進增殖,遷移和分化,并抑制細胞凋亡,但在部分癌癥中,miR-155抑制增殖和遷移,并促進細胞凋亡[9]。因此,miR-155在不同癌細胞類型中充當腫瘤促進或腫瘤抑制因子。在本研究中,發現miR-155在結腸癌細胞中充當腫瘤因子。據報道,miR-155在結腸癌中過度表達,但miR-155在結腸癌中的作用仍有待完全闡明[5]。研究發現基于納米顆粒的抗miR-155療法在miR-155依賴性淋巴瘤小鼠模型中具有出色的治療效果[10]。miR-155通常與預后不良相關,可能成為結直腸癌治療的關鍵靶點。在本研究中,發現miR-155在結腸癌細胞中充當腫瘤因子,促進其增殖,細胞周期和遷移,但抑制細胞凋亡。部分研究結果與本研究的結果一致,miR-155與結腸癌細胞的增殖,遷移和侵襲有關[5]。miR-155可能是結腸癌治療的一個有前途的治療靶點。

HuR是一種癌癥相關RNA結合蛋白(RBP),是胚胎致死性異常視力(ELAV)家族的成員,它通過與3'非翻譯區(UTR)內的保守富AU元件(ARE)結合來增加mRNA的穩定性,從而防止基因降解[11]。HuR表達在不同腫瘤中均上調,包括乳腺癌、結直腸癌、胃癌和前列腺癌,與臨床病理參數先進、腫瘤相關蛋白表達、生存率低、預后差相關。CRC相關研究表明,HuR通過靶向細胞質中的RNA上調并促進結腸癌生長[12]。此外,細胞質中HuR蛋白的增加與T分期相關,重要的是,HuR過表達增加了裸鼠模型中結腸癌細胞的生長。此外,miR-22作為一種腫瘤抑制性miRNA,直接與HuR結合并下調其表達以抑制CRC的增殖和遷移能力,以及異種腫瘤生長[13]。在本研究中,使用RT-qPCR,蛋白質印跡分析和熒光素酶報告基因測定將HuR確定為miR-155的新靶標。

本研究指出,miR-155可促進增殖,阻斷S期細胞周期,促進結腸癌細胞遷移,抑制其凋亡。HuR的生物學功能與miR-155一致,被確定為miR-155的目標。本研究結果表明,miR-155通過靶向HuR在結腸癌細胞中發揮腫瘤作用,miR-155可能成為結腸癌的有希望的治療靶點。