夾脊電針通過TLR4/NF-κB 信號通路干預神經根型頸椎病大鼠炎癥機制的研究*

王智元 鄭曉涵 楊旭霞 王文韜 謝 希 張筱尤 高 曦

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

頸椎病是一種以頸椎椎間盤退變為主要致病因素的疾病，臨床上可出現頸背僵硬、疼痛、上肢放射性疼痛等伴隨癥狀。按照其累及的周圍組織結構不同，將其分為神經根型、頸型、脊髓型、交感神經型和椎動脈型5種類型［1］，其中神經根型占比最高［2］。中醫對于神經根型頸椎病（CSR）的治療方法有針灸、推拿、針刀、中藥內服與外用等，其中電針療法在臨床較為常見。現代研究已經證實了電針對CSR 能夠起到緩解疼痛，消除或減輕增生物壓迫造成的炎癥、水腫，改善頸椎周圍微循環等作用［3］，但目前對于夾脊電針治療CSR 的作用機制研究較少。本實驗研究以CSR大鼠為研究對象，探討夾脊電針對其的作用效應和消炎機制，以期為夾脊電針治療CSR的臨床運用提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～7 周齡的SD 雄性大鼠，購自黑龍江中醫藥大學醫學動物實驗中心，體質量300～350 g，動物許可證號：SYXK（黑）2021-010。動物在黑龍江中醫藥大學醫學動物實驗中心飼養，溫度（22±2）℃，濕度50%左右，12 h 循環照明，自由飲食攝水。實驗過程遵照動物的使用及倫理學相關規定［4］。

1.2 試藥與儀器

阿莫西林膠囊（通藥制藥集團股份有限公司，產品批號：221222）、大鼠白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）、大鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）、TLR4 抗體（北京博奧森生物技術有限公司，貨號bs-1021R）、NF-κB p65 抗體（北京博奧森生物技術有限公司，貨號bs-20159R）、TRAF6 抗體（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號FNab08921）、兔抗GAPDH 抗體［生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號D110016］、HRP 山羊抗兔IgG（H+L）（武漢三鷹生物技術有限公司，貨號SA00001-2）。DNM-9602 酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）、一次性無菌針灸針（長春愛康醫療器械有限公司）、KWD-808Ⅰ型脈沖針灸治療儀（常州英迪電子醫療器械有限公司）、TS-2000A多用脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、EPS300數顯穩壓穩流電泳儀（上海天能科技有限公司）、VM-300S 漩渦混勻儀（群安實驗儀器有限公司）、VE-60 微型垂直槽多板灌膠器（上海天能科技有限公司）、ICEN-24R 臺式高速冷凍離心機（杭州奧盛儀器有限公司）、MDB100C 金屬浴（群安實驗儀器有限公司）、DHP9162電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）。

1.3 分組與造模

將75 只SD 大鼠隨機分為5 組：空白對照組、假手術組、模型組、針刺組和電針組，每組15 只。用化學誘導法［5］對模型組、針刺組和電針組構建CSR模型，假手術組不進行化學誘導僅手術。1）麻醉與固定：大鼠經腹腔注射麻醉后俯臥位（選用戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射）固定于操作臺上，頸前部墊5 mL 注射器，以使頸椎后突便于操作。2）準備：致炎物選擇在0.5%甲醛中浸泡24 h的定量濾紙片（1 mm×1 mm）。去除頸背部毛發，碘伏消毒（以T1～T2正中切口為中心消毒周圍4～5 cm），然后鋪蓋無菌洞巾，顯露T1～T2正中區域（T2為大鼠頸部第2 個高突點）。3）手術：以T1～T2正中切口，沿著棘突縱行切開皮膚和皮下組織（逐層切開），切口約2 cm，用手術刀鈍性分離棘突兩側肌肉，拉鉤拉開肌肉，鈍性分離暴露棘突和右側椎板，然后用顯微持針鉗咬去T1椎板，顯露出右側C8神經根，仔細分離神經根和周圍組織（務必不能損傷神經），然后將甲醛濾紙片放在暴露的神經根腋下。假手術組僅顯露C8神經根，而不放置甲醛濾紙片。逐層縫合，關閉切口，縫合中在切口均勻涂抹阿莫西林膠囊。最終術中死亡2 只，術后死亡3只，每組取12只。

1.4 干預方法

模型成功后，從第3 天開始各組大鼠予以干預。假手術組、模型組予捆綁15 min，每日1 次，持續10 d。針刺組俯臥位捆綁大鼠后，針刺部位消毒，使用一次性無菌針灸針針刺大鼠C7～T13 對頸夾脊穴，穴位定位參照大鼠穴位圖譜［6］，得氣后留針15 min，每日1次，持續10 d。電針組俯臥位捆綁大鼠后，取C7～T13 對頸夾脊穴，電針正負極左右交替聯，疏密波，頻率5 Hz，電流強度2.5 mA（以大鼠頸肌及前肢輕度抖動為度），每日1次，每次15 min，持續10 d。空白組不予干預。

1.5 觀察指標

1.5.1 步態評分 結合Kawakami 與Dubuisson 法對大鼠由疼痛攣縮造成的步態障礙進行評估。從造模前1 d起每日評定，正常步態、足無畸形計為1分；受損傷足輕觸玻璃臺面、不持重或輕微持重、走時跛行或足內收蜷縮畸形計為2分；走動時不著臺面計為3分。

1.5.2 抓桿法評定 手持一根一次性筷子，使其平行于地面并位于距地面0.5 m處。抓取大鼠，將大鼠雙前爪置于桿上，令其充分抓握后使其懸吊于桿上，用秒表記錄大鼠雙前肢的抓桿時間。另外，將雙前肢抓握能力相近者計為1 分；右前肢能抓握但抓握能力明顯弱于左前肢者計為2分；右前肢無法抓握者計為3分。從造模前1 d起每日評定。

1.5.3 ELISA 法檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α 含量大鼠經腹腔注射麻醉后仰臥位（選用戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射）固定于操作臺上，先自腹部動脈取血，而后取C8神經根。將血液靜置2 h 后進行離心，抽取上層血清，用ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，嚴格參照說明書進行，于450 nm 波長下讀取光密度（OD）值，根據OD值計算上述檢測因子含量。

1.5.4 Western blotting 法檢測神經根組織中的TLR4、TRAF6、NF-κB-p65 蛋白表達水平 取大鼠神經根組織，加入蛋白提取劑（RIPA 裂解緩沖液∶PMSF 蛋白酶抑制劑=100∶1）抽提神經根組織總蛋白，4 ℃離心機10 000 r/min 離心10 min，取上清液，BCA 法測定上清液總蛋白濃度，加入含溴酚藍染料的上樣緩沖液和RIPA 裂解緩沖液將總蛋白濃度調整至6 mg/mL，而后100 ℃金屬浴加熱變性5 min。用10%的SDSPAGE 電泳分離蛋白，而后用濕轉法將蛋白轉印至PVDE 膜上。用5%的脫脂牛奶在搖床上室溫封閉2 h，加入TLR4、TRAF6、NF-κB-p65 一抗（1∶1 000）在4 ℃冰箱中過夜，TBST 洗膜5 次，每次8 min。用HRP 標記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，再次洗膜。將ECL 工作液均勻的滴加在膜上，避光孵育1 min，使用化學發光圖像處理系統掃膜，將蛋白條帶圖像保存下來。

1.6 統計學處理

采用GraphPad Prism9.5.1 軟件。計量資料均以（±s）表示，多組間比較符合正態分布采用單因素方差分析，不符合正態分布采用非參數秩和檢驗，組間差異比較采用Tukey's 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 模型評價

見表1、表2。造模3 d 后模型組、針刺組和電針組大鼠表現出倦臥少動等特征。造模后模型組、針刺組及電針組大鼠步態評分和大鼠抓桿評分相近（P＞0.05）。與空白組大鼠相比，模型組、針刺組和電針組大鼠的步態和抓桿評分受到較大影響（P＜0.01），而假手術組由于僅用顯微持針鉗咬去T1椎板，顯露出右側C8神經根，未進行化學誘導，故相較于模型組、針刺組及電針組，對大鼠步態和抓桿評分影響較小（P＞0.05）。

表1 各組大鼠步態評分比較（分，±s）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05；與針刺組比較，△P ＜0.05。下同。

干預后1.00±0.00 1.08±0.28 2.33±0.48 1.63±0.58#1.13±0.34#△組 別空白組假手術組模型組針刺組電針組n 12 12 12 12 12造模后1.00±0.00 1.17±0.38 2.50±0.51**2.59±0.50**2.67±0.48**

表2 各組大鼠抓桿評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠抓桿評分比較（分，±s）

組 別空白組假手術組模型組針刺組電針組n 12 12 12 12 12造模后1.00±0.00 1.21±0.41 2.58±0.50**2.67±0.48**2.63±0.49**干預后1.00±0.00 1.04±0.20 2.17±0.48 1.58±0.50#1.17±0.38#△

2.2 各組大鼠步態評分比較

見表1。干預結束后模型組、針刺組和電針組的步態情況均有所好轉（P＜0.05）。相較于模型組，經過干預后針刺組及電針組干預后大鼠步態顯著好轉（P＜0.05），且電針組大鼠步態好轉情況更明顯（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠抓桿評分比較

見表2。干預結束后模型組、針刺組和電針組的大鼠抓桿情況均有所好轉（P＜0.05）。相較于模型組，經過干預后針刺組及電針組干預后大鼠抓桿情況顯著好轉（P＜0.05），且電針組大鼠抓桿情況好轉情況更明顯（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較

見表3。與空白組比較，假手術組大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量升高不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05），與假手術組比較，模型組大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，針刺組和電針組大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量均降低（P＜0.05）；相較于針刺組，電針組大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與假手術組比較，▲P ＜0.01。

組 別空白組假手術組模型組針刺組電針組TNF-α 204.35±56.33 211.39±46.78 384.91±17.09▲303.88±42.05#239.09±40.39#△n 12 12 12 12 12 IL-1β 25.79±3.75 28.92±3.83 47.02±4.19▲41.07±2.30#34.72±3.29#△IL-6 86.89±12.27 89.09±10.59 128.86±15.01▲111.82±13.07#95.09±6.0281#△

2.5 各組大鼠神經根組織TLR4、TRAF6、NF-κB p65蛋白表達比較

見圖1。結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠神經根組織TLR4、TRAF6、NF-κB p65 蛋白表達明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，針刺組和電針組大鼠神經根組織TLR4、TRAF6、NF-κB p65 蛋白表達均降低（P＜0.01），且相較于針刺組，電針組大鼠神經根組織TLR4、TRAF6、NF-κB p65 蛋白表達降低更明顯（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠神經根組織TLR4、NF-κB p65、TRAF6 p65蛋白表達

3 討 論

目前醫學上對CSR 的病理機制雖然并未完全明確，但認為其主要與機械性壓迫、炎性因子浸潤或損傷對神經根的刺激以及疼痛等傷害性信息的傳導密切相關［7］。王小云等［8］研究表明，椎間盤或神經根出現局部炎癥反應，導致一氧化氮、白介素等炎性因子的浸潤或損傷對神經根的刺激則是神經根產生疼痛進而引起肩臂痛的主要原因之一，但并未對炎性因子增多的機制進行探索。Tsukasa Onozawa 等［9］研究表明，在神經根受到損傷的過程中炎癥因子產生的多種化學物質使中樞神經接受了大量傷害性信息，導致其敏感性增高，也是神經根疼痛的病因之一，但此研究并未涉及其相關炎癥通路。因此積極探索與之相關的炎癥通路與發生機制及高效的治療方法，對臨床治療CSR 具有重要意義。

電針是指針刺得氣后，在針上通以微弱的連續波或斷續波，從而起到刺激穴位、治愈病癥的目的。現代醫學常用其治療局部炎性改變。任祥等［10］的研究已經證實了電針對CSR 能夠起到緩解疼痛，消除或減輕增生物壓迫造成的炎癥、水腫，改善頸椎周圍微循環等作用。夾脊穴位于椎棘突下，后正中線旁開0.5 寸，刺激穴位有調節自主神經的作用。在臨床常用于緩解疼痛。王勇等［11］的研究表明針刺夾脊穴在臨床上能有效緩解CSR 患者的癥狀和體征，明顯減輕CSR 患者的疼痛，但并未將其與電針相結合。本研究將電針與夾脊穴相結合，以期為臨床提供新的思路。

現代研究證明TLR4/NF-κB 信號通路是免疫應答中起重要作用的炎癥信號通路之一［12］。有研究［13］表明游離脂肪酸可以通過直接與TLR4 結合來激活髓樣分化因子88（MyD88）依賴性途徑，然后通過MyD88 和IL-1 受體相關激酶（IRAK）激活NF-κB，使NF-κB p65進入細胞核并轉錄激活下游炎癥因子IL-6，觸發免疫炎癥反應。TRAF6是一種重要的NF-κB調節因素［14］，可以通過自身的泛素化修飾活化kappa B 抑制因子激酶（IKK）激酶轉化生長因子激酶1（TAK1），TAK1 則可與TAB3 結合進而激活NF-κB 通路。TNF-α 為炎癥反應的啟動因子，生理狀態下有助于增強免疫力和抑制腫瘤生長，但過度表達時可增大和加重炎癥反應，引起多種病理損傷［15］。在CSR 發展期TNF-α 的含量與椎間盤的退變和疼痛呈正相關，TNF-α 能誘導NF-κB信號通路的活化，活化調節炎癥反應的細胞因子IL-6的表達，增加炎癥細胞的活性及聚集性［16］。且IL-1β也可以與IFN-γ 結合來驅動IL-6 的產生，促進機體免疫炎癥進程［17］。所以通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路，減少IL-1β、IL-6、TNF-α 的產生與表達是緩解CSR炎性反應的重要機制。

本研究顯示，使用夾脊電針干預可以顯著改善CSR 大鼠的步態和抓桿情況，抑制了TLR4、TRAF6、NF-κB p65的蛋白表達，降低了IL-1β、IL-6、TNF-α的產生，緩解了CSR 大鼠的疼痛。研究將普通針刺組作為陽性對照，顯示電針與普通針刺的作用機制相似，但電針對TLR4、TRAF6、NF-κB p65 的蛋白表達的抑制和對IL-1β、IL-6、TNF-α 的降低更明顯。研究設置假手術組，以排除造模對大鼠傷害對TLR4、TRAF6、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNF-α的影響。

綜上所述，本研究結果顯示夾脊電針可以改善CSR 模型大鼠的步態和抓桿情況，緩解了CSR 模型大鼠的疼痛，且抑炎作用明顯。夾脊電針減少IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達，并抑制TLR4/NF-KB 信號通路是緩解CSR炎性反應的關鍵機制之一。由于本研究僅集中于單一途徑與部分靶點，缺乏統一聯系，限制了實驗研究向臨床應用的轉化。在后續研究中，需要通過更多實驗從其他新途徑與新靶點進一步揭示夾脊電針治療CSR的相關機制；同時通過大樣本動物實驗，對比研究不同取穴標準對于CSR 療效的影響，以期為臨床提供更多幫助。