速溶黃大茶輔助降血糖功能及機制研究

李 睿,馬 征,李心偉,朱 玉,王一君,羅勝勇*

(1.安徽省醫學科學研究院,安徽 合肥 230061;2.安徽醫學高等專科學校,安徽 合肥 230601; 3.安徽農業大學 茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室,安徽 合肥 230061)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一種由多種病因引起的,以體內糖、脂肪、蛋白質、水和電解質紊亂為特征的代謝性疾病[1],其病因主要牽涉機體胰島功能的減退及靶組織對胰島素敏感性的降低。而長期的高血糖則會引起多種并發癥,如視網膜病變、腎病以及神經病變等,且病程無法逆轉[2]。目前,根據WHO標準,將糖尿病分為四型,分別為Ⅰ型、Ⅱ型、妊娠期及其他特殊類糖尿病。其中Ⅱ型糖尿病為主要的發病類型,發病人數占我國糖尿病總發病人數的95%左右[3]。目前臨床對于Ⅱ型糖尿病的治療仍以口服化學性藥物及注射胰島素為主,但化學性藥物普遍存在安全劑量范圍小、毒副反應大等不良作用[4],因此尋找一種天然化合物替代化學性藥物已成為當今預防和治療糖尿病發生的一種新思路。

大葉黃茶(Large-leaf yellow tea,LYT)是中國茶葉中的一種特色類型,產自安徽省霍山縣,由成熟的葉和莖沖泡而成。已有研究發現,與綠茶或紅茶等其他茶相比,LYT在調節血糖方面具有明顯優勢[5,6]。速溶黃大茶(Instant Huangda tea,IHT)是利用大葉黃茶進行深加工制成的一類保健食品,其口味及便捷性更加符合目前大眾的健康飲食需求。為了明確速溶黃大茶的輔助降血糖作用,本研究擬借助地塞米松誘導胰島素抵抗糖脂代謝紊亂模型,初步探討速溶黃大茶的降血糖作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選取SD雄性大鼠80只,體質量(150±20)g,由南通大學提供,合格證號:20200906,飼養于安徽省醫學科學研究院屏障實驗室內(許可證號:SCXK(皖)2019-008),溫度18～24℃,相對濕度40% ～70%,實驗期間各組動物按試驗方案攝食飲水。

1.1.2 試劑與儀器 速溶黃大茶(IHT),黃色粉末,由安徽農業大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室提供(批號:20181115,規格:2.5g/袋,人用量為1袋/d,實驗時用蒸餾水配成0.42g/mL母液);醋酸地塞米松注射液(批號:20190912),購于上海通用藥業股份有限公司;標準實驗鼠糧、高熱能鼠飼料(規格:25kg/袋),購于江蘇省協同醫藥生物工程有限公司;大鼠胰島素(Ins)ELISA試劑盒,購于深圳子科生物科技有限公司;α-葡萄糖苷酶(酶活力為14.72U/mg),購于美國Sigma公司;阿卡波糖(批號:20200115)、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG,批號:20191004),購于北京索萊寶科技有限公司。茶多酚標準品(批號:DSTDC013001)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)標準品(批號:DSTDB003601),均購于成都德思特生物技術有限公司。DS-3型血糖儀,購于翔國科技有限公司;DS-671電子秤,購于上海寺岡電子有限公司;IMARK酶標儀,購于bio-rad公司;7020生化分析儀,購于日本日立公司;LC-20AT高效液相色譜儀,購于日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC測定IHT中EGCG及茶多酚的含量 稱取0.2077g IHT溶于甲醇定容至10mL,超聲30vmin后,0.45μm濾器過濾,取其中1mL溶液加入甲醇,定容至5mL(稀釋5倍);稱取茶多酚標準品2.659mg,溶于甲醇定容至10mL;稱取EGCG標準品0.495mg,溶于甲醇定容至10mL;分別進樣,測定其高效液相色譜。

1.2.2 速溶黃大茶劑量選擇及給予方式 IHT人體推薦量為2.5g/d,即42mg/kg。采用大鼠進行實驗,以人體推薦量的2.5、5、10倍劑量作為相應劑量,分為105mg/kg、210mg/kg、420mg/kg共3個劑量組。用蒸餾水將IHT溶解成1.05g/100mL、2.1g/100mL、4.2g/100mL共3個濃度。灌胃給予相應濃度IHT,灌胃容積1mL/100g。

1.2.3 對正常大鼠空腹血糖的影響 選取SD大鼠30只,隨機分為對照組和IHT組兩個劑量組,每組15只。受試樣品組給予高濃度(4.2g/100mL)IHT,對照組給予同體積溶劑(蒸餾水)。連續給30d后,禁食4h測空腹血糖值,比較兩組空腹血糖值。

1.2.4 模型建立及給予受試樣品 選取SD大鼠50只,普通維持料適應飼養3d后,禁食4h,測定空腹血糖值(0h),之后灌胃給予2.5g/kg BW葡萄糖并測定0.5、2h血糖值。以所測值將大鼠分為5組,每組10只,分別為空白對照組、模型組、IHT3個劑量組。3個劑量組灌胃給予相應濃度IHT,空白對照組不進行處理,模型對照組給予同等體積溶劑,連續35d。其中第1周各組給予維持料飼養,1周后模型對照組和3個劑量組更換高脂飼料進行飼喂,2周后模型對照組和3個劑量組在高脂飼料基礎上,分別給予0.8mg/kg BW地塞米松腹腔注射,1次/d,連續14d。實驗結束,各組動物禁食4h,之后按相應指標檢測。實驗流程,見圖1A。

圖1 EGCG的HPLC

1.2.5 測定給樣后空腹血糖 各組動物禁食4h后,尾部取血,用血糖儀測定血糖值,即為空腹血糖值,比較各組大鼠血糖值及血糖下降的百分率。計算公式:

1.2.6 給樣后糖耐量測定 以空腹血糖值作為給葡萄糖前(0h)血糖值,IHT組給予不同濃度IHT,模型對照組給予同體積溶劑,空白對照組不做處理,20min后各組經口給予葡萄糖2.5g/kg BW,測定給葡萄糖后各組0.5、2h的血糖值,若模型對照組0.5h血糖值≥10mmol/L,或模型對照組0.5、2h任一時間點血糖升高或血糖曲線下面積升高,與空白對照組比較,差異有顯著統計學意義,則判定糖代謝紊亂模型成立,在此基礎上,觀察模型對照組與IHT組空腹血糖、給葡萄糖后(0.5、2h)血糖及0、0.5、2h血糖曲線下面積的變化。計算公式:

1.2.7 給樣后血清中膽固醇、甘油三酯含量測定 各組動物禁食4h,采用7020生化分析儀檢測血清中膽固醇、甘油三酯含量。

1.2.8 給樣后胰島素抵抗指數測定 各組動物禁食4h,ELISA法檢測血清胰島素,按下式計算胰島素抵抗指數:

1.2.9 α-葡萄糖苷酶活性測定 取40μL α-葡萄糖苷酶液(0.04U/mL)和40μL IHT于試管中,其中IHT高、中、低劑量組的濃度分別為4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL,將混合物于37℃水浴5min,之后加入20μL PNPG底物溶液(0.5mmol/L),37℃水浴30min,繼續加入50μL Na2CO3溶液(0.2mol/L)終止反應,室溫5min,采用酶標儀于405nm 處測定吸光度值A(檢測結果,見表1)。此外,另設阿卡波糖(1mg/mL)作為陽性對照組,每組設6個復孔,按照下式計算抑制率:

表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗反應體系 (μL)

1.3 統計學方法

2 結果與分析

2.1 IHT中EGCG及茶多酚含量

結果如圖1、圖3所示,EGCG的保留時間為17.834min,峰面積為688 318;IHT中EGCG保留時間為17.799min,峰面積為3 483 238;通過計算得IHT中EGCG的含量為30.23mg/g。此外根據圖2所示,茶多酚中EGCG的保留時間為17.811min,峰面積為2 058 964,計算可得茶多酚中EGCG的含量為556.86mg/g,由此推算IHT中茶多酚含量約為5.43%。

圖2 茶多酚的HPLC

圖3 IHT的HPLC

2.2 對正常大鼠空腹血糖的影響

灌胃給予IHT 35d后,與空白對照組相比,IHT高劑量組大鼠空腹血糖無明顯差異,可判定IHT對正常大鼠血糖無影響,可以進行后續實驗。見表2。

表2 對正常大鼠空腹血糖影響

2.3 對地塞米松誘導胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠體質量的影響

與正常對照組比較,模型組大鼠在給予地塞米松之后體質量呈逐漸下降趨勢;與模型組比較,IHT 3個劑量組均能有效逆轉模型組大鼠體質量下降趨勢。見圖4。

圖4 IHT對模型大鼠體質量的影響

2.4 對地塞米松誘導胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠空腹血糖的影響

與空白對照組比較,模型組大鼠空腹血糖及血糖下降率無明顯改變(P>0.05);與模型對照組比較,IHT 3個劑量組大鼠空腹血糖及血糖下降率也無明顯改變(P>0.05)。見表3。

表3 IHT對模型大鼠空腹血糖的影響

2.5 對地塞米松誘導胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠糖耐量的影響

各組大鼠經灌胃給予葡萄糖后,模型組大鼠0.5h血糖值(13.49mmol/L)≥10mmol/L,且與空白對照組比較,血糖下曲線面積明顯升高(P<0.01),可判定糖代謝紊亂模型成立。與空白對照組比較,模型組大鼠血糖在0.5、2h升高(P<0.05),血糖曲線下面積明顯升高(P<0.01);而與模型組比較,IHT3個劑量組0.5、2h血糖明顯下降,曲線下面積明顯下降(P<0.01)。見表4。

表4 IHT對模型大鼠糖耐量的影響

2.6 對地塞米松誘導胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠血清膽固醇、甘油三酯的影響

與空白對照組比較,模型組大鼠血清總膽固醇、甘油三酯明顯升高,差異有顯著統計學意義(P<0.01)。與模型對照組比較,IHT高、中劑量組血清總膽固醇含量降低(P<0.05),甘油三酯無明顯變化(P>0.05);IHT低劑量組血清總膽固醇及甘油三酯含量均無明顯改變(P>0.05)。見表5。

表5 IHT對模型大鼠總膽固醇、甘油三酯的影響

2.7 對地塞米松誘導胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠血清胰島素抵抗指數的影響

與空白對照組比較,模型組大鼠血清胰島素水平明顯升高,胰島素抵抗指數升高,差異有顯著統計學意義(P<0.01)。與模型對照組比較,IHT高、中劑量組血清胰島素水平降低(P<0.05),胰島素抵抗指數下降(P<0.05);IHT低劑量組可減少血清胰島素水平(P<0.01),而對胰島素抵抗指數無明顯影響(P>0.05)。見表6。

表6 IHT對模型大鼠胰島素抵抗指數的影響

2.8 對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

IHT 3個劑量組均能對α-葡萄糖苷酶產生抑制作用(對α-葡萄糖苷酶的抑制率均>50%)。IHT高劑量組與IHT中劑量組對α-葡萄糖苷酶抑制率分別為(62.74±4.17)%以及(61.58±5.93)%,與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率(60.22±3.56)%,無明顯差異(P> 0.05);而IHT低劑量組對α-葡萄糖苷酶抑制率為(54.41±4.04)%,與阿卡波糖相比,有統計學差異(P<0.05)。見圖5。

注:與阿卡波糖組比較,*P<0.05。

3 結語

Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)是糖尿病中較為常見的一種類型,其臨床特征表現為血漿葡萄糖異常升高,其發生機制主要與胰島β細胞功能障礙和不同程度的胰島素抵抗引起的糖、蛋白質、脂肪代謝紊亂有關[7-8],而IHT研究主要針對調控Ⅱ型糖尿病。因此,根據以上T2DM的特征,本研究選用了高脂飼料誘導(4周)聯合低劑量地塞米松注射(14d)的方法建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型[9],結果顯示,造模后與正常對照組大鼠比較,模型組大鼠體質量明顯降低,血清中總膽固醇、甘油三酯含量明顯升高,同時伴隨胰島素抵抗指數增加,此外,模型組大鼠0.5、2h血糖值和血糖曲線下面積均高于正常對照組大鼠,提示大鼠胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型建立成功,能夠模擬Ⅱ型糖尿病模型,可為后續藥物干預提供實驗基礎。

目前,臨床上治療T2DM的藥物主要包括胰島素及一些口服性降血糖藥物,包括磺脲、雙胍和糖苷酶抑制劑等,但此類藥物在臨床應用時存在較多副作用,包括胃腸功能障礙、體質量增加、低血糖和胰島素抵抗[10],因此,尋找一些毒性和副作用較小的天然產物替代化學性藥物治療發病初期的血糖異常患者有著重要的意義。IHT是一種具有保健作用的食品,茶多酚中的EGCG是其主要組成成分之一。已有研究表明,TP中的EGCG有顯著的降低血糖作用[11,12]。本研究發現,與模型組比較,IHT能夠明顯降低大鼠給予葡萄糖后0.5h及2h的血糖值,且曲線下面積也明顯下降,提示IHT能夠升高模型組大鼠的糖耐量指標。此外,IHT能夠明顯降低血清中總膽固醇含量及胰島素抵抗指數,但是對模型大鼠空腹血糖無明顯作用。因此可推測IHT的輔助降血糖作用主要與調控餐后血糖水平有關。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是糖苷水解酶大家族中的一類,其在生物體內分布廣泛,主要參與生物體內的食物代謝、多糖和糖蛋白的合成等[13]。當機體攝入食物(淀粉)后,唾液淀粉酶能將多糖消化成寡糖,而α-葡萄糖苷酶則能將進入小腸的寡糖分解為單個葡萄糖,并為小腸吸收,升高餐后血糖水平[14]。因此可以通過抑制小腸內α-葡萄糖苷酶的活性,延緩或降低葡萄糖在腸道內的吸收,調整機體血糖的水平,改善Ⅱ型糖尿病患者的臨床癥狀[15]。此外有文獻報道,EGCG能夠顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性[16],本研究也發現IHT3個劑量組均能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性(抑制率>50%),且與陽性藥物阿卡波糖相比,IHT高、中劑量組對α-葡萄糖苷酶抑制率無明顯差異,提示我們IHT對地塞米松誘導胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型大鼠輔助降血糖作用與抑制α-葡萄糖苷酶活性有關。

綜上所述,IHT作為一種新型保健食品,具有明確的輔助降血糖作用,并具備對Ⅱ型糖尿病預防和治療的潛力,而其作用機制主要與抑制α-葡萄糖苷酶活性有關。