北京信鴿中1株禽白血病病毒的分離和鑒定

張帥華, 常建宇

(中國農業大學動物醫學院, 北京 海淀 100193)

禽白血病(Avian leukemia)是由禽白血病病毒(Avian leukemia virus,ALV)引起的以造血細胞惡性增生為主要癥狀的傳染性疾病,該病臨床病理癥狀多種多樣,包括淋巴細胞白血病(Lymphocytic leukemia)、成髓細胞白血病和骨髓細胞瘤等,是危害養禽業的重要疾病之一,ALV幾乎可以感染世界上所有商品種雞群[1-4]。雞感染ALV后,一般不會表現出臨床癥狀,死亡率較低,但會嚴重影響其生產性能,導致產蛋量和蛋品質下降[5-8]。隨著我國養禽業的規模化和集約化發展,禽類傳染病已經成為制約我國養禽業發展的因素之一。近10年來,我國已經有很多關于AL的報道,但大多數報道都集中在家禽上,對鴿子乃至野生鳥類的報道罕見[9,10]。鴿子具有長途遷徙的特點,一旦鴿子攜帶ALV,極大概率會加劇ALV在禽類中的傳播。因此,對鴿群進行有關ALV 的調查十分有必要。本試驗采集北京市沙河地區某市場54只疑似AL信鴿的血漿樣本,通過接種雞胚成纖維細胞(DF-1細胞)分離得到1株ALV,并通過抗體檢測、gp85基因核苷酸序列分析和遺傳進化樹構建確定了該分離毒株為A亞群ALV。本試驗為更好了解和掌握ALV 在鴿群中的感染情況和毒株發展特點,以及鴿群ALV的防控和凈化提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備 ZW-A 微量振蕩器,常州國華電器有限公司;L-200 迷你離心機,海門市其林貝爾儀器有限公司;PCR 儀,賽默飛世爾科技公司;電泳儀,北京君意東方電泳設備有限公司;凝膠成像系統,上海山富科學儀器有限公司;生物安全柜,北京東聯哈爾儀器制造有限公司;電熱恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 主要試劑 超純水(Diethypyrocarbonate water,DEPC水),購自北京索萊寶科技有限公司;2×TapPCR Master Mix,購自北京強欣博瑞生物技術有限公司;DL2 000 Marker、Easy Pure Genomic DNA Kit、X-gal、pEASY-T1 Simple Cloning Kit 和感受態細胞,均購自北京全式金生物技術有限公司;0.25%胰酶、DMEM和胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS),均購自 GIBCO公司;Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit Ag、Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit Ab和Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit J,均購自 IDEXX 公司;DNA 凝膠回收試劑盒,購自廣州東盛生物技術有限公司;細胞基因組 DNA 快速提取試劑盒,購自艾德萊生物科技有限公司。DF-1細胞由本實驗室保存。

1.3 實驗動物 20只7周齡SPF級白來航雞,購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2019—0007。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣本采集和處理 從北京市沙河地區某市場抽樣采取疑似AL信鴿樣本(表1),共54只。該市場的信鴿群來自于北京及其周邊,鴿群來源廣泛。以無菌靜脈采血的方式采取54只信鴿的抗凝血樣本2 mL,依次命名為A1～A54,將樣本2 000 r/min離心20 min,分離出血漿和血細胞,分別保存于-80 ℃冰箱中。

表1 樣本采集信息

1.4.2 病毒的分離和鑒定 取24孔細胞培養板,每孔加入500 μL DF-1細胞懸液。前2孔設為陰性對照和陽性對照,其余每孔加入15 μL血漿樣本。各孔加入10% DMEM 100 μL,37 ℃、5%CO2條件下培養48 h。棄上清液,用無菌PBS沖洗2次,換成2%DMEM維持生長,于37 ℃、5%CO2條件下連續培養9 d后,使用 Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit Ag試劑盒特異性檢測p27抗原,血漿樣本與陽性對照的吸光度(Optical density,OD)比值(S/P)大于0.200時,判為陽性樣本。

1.4.3 ALV前病毒DNA的制備 取陽性樣本的DF-1細胞上清液接種于新長成的單層 DF-1 細胞,連續傳代3次,使用細胞基因組 DNA 快速提取試劑盒提取 DF-1 細胞 DNA,得到ALV前病毒DNA,并根據Reed-Muench法[8]計算半數組織培養感染量(Tissue culture infective dose,TCID50)。

1.4.4 分離株抗體檢測 將20只7周齡 SPF 雞隨機平均分為2個組,一組為對照組,一組為試驗組,常規飼養3 d后,對照組每只SPF雞腹腔注射500 μL超凈水,試驗組每只SPF雞腹腔注射500 μL 3×103TCID50分離株病毒稀釋液,繼續飼養7 d,采集每只SPF雞的靜脈血2 mL,放入促凝管中,2 000 r/min離心20 min,分離血清和血細胞。使用 Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit Ab和J試劑盒檢測樣本分離血清中的抗體,樣本與陽性對照的OD比值(S/P)大于0.40時,判為陽性樣本。

1.4.5 分離株env基因PCR擴增和測序 根據趙冬敏等[11]針對各亞群ALVenv基因設計的通用引物(表2),應用PCR擴增分離株的env基因,同時設置陽性對照和陰性對照。PCR反應程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,35個循環;72 ℃延伸 10 min。取5 μL的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,程序為120 V,25 min。使用DNA凝膠回收試劑盒將PCR擴增為陽性的條帶進行回收凈化,產物與EASY-T1 Simple Cloning Vector連接,將連接產物轉入Trans1-T1大腸桿菌中,接種LB平板過夜培養。挑取單菌落進行PCR擴增,PCR反應程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 4 min,30個循環;72 ℃延伸10 min。將PCR鑒定為陽性的質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表2 env基因引物序列

1.4.6 分離株gp85基因序列分析env基因由gp85基因和gp37基因組成,其中gp85基因是鑒定ALV亞群的主要依據[12]。將測序得到的gp85基因序列在 NCBI BLAST中與GenBank中已發表的16株不同亞型ALV進行gp85基因核苷酸序列同源性比較(表3),并用 DNASTAR 和 MEGA 6.0軟件分析序列和構建系統發育進化樹。

表3 各亞群 ALV 參考株信息

2 結果

2.1 p27抗原檢測 54份鴿子血漿樣本 A1～A54的p27抗原檢測結果顯示,A5樣本的S/P值為0.346(>0.200),為陽性樣本,其余樣本的S/P值均小于0.200,為陰性樣本,陽性率為1.9%(1/54),將分離獲得的1株ALV毒株命名為 CAU1501。

2.2 TCID50檢測 利用Reed-Muench法計算得到CAU1501的TCID50為10-4.4/0.1 mol。

2.3 分離株抗體檢測 20份待檢SPF雞血清樣本用Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit J試劑盒進行檢測,結果顯示,對照組和試驗組的 SPF雞血清樣本均為陰性。20份待檢SPF雞血清樣本用 Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit Ab 試劑盒進行檢測,結果顯示,對照組10份SPF雞血清樣本S/P 值均小于 0.40,為陰性樣本;在試驗組10份SPF雞血清樣本中,有4份血清樣本的S/P值大于0.40,為陽性樣本,陽性率為 40%(4/10)。

2.4 分離株env基因PCR擴增和測序 以分離獲得的1份ALV前病毒DNA為模板,以env all為引物,對分離株CAU1501env基因進行PCR擴增,結果如圖1所示,分離株 CAU1501可擴增出約1 900 bp的目的條帶,與預期片段大小一致。測序結果顯示,分離株 CAU1501env基因全長為 1 821 bp,編碼 607 個氨基酸。將該序列提交到 NCBI BLAST 驗證確為禽白血病病毒env序列。

圖1 分離株env基因的PCR擴增

2.5 分離株gp85基因序列分析 分離株 CAU1501gp85基因全長為1 030 bp,編碼 343 個氨基酸。分析結果如圖2示,CAU1501gp85基因與A亞群ALV參考株PDRC-3249(2007年美國分離株)同源性最高,為89.2%;與J亞群參考株SD1005(2010年山東分離株)同源性最低,僅為 29.7%。

圖2 分離株 CAU1501與各亞群 ALV 參考毒株gp85基因核苷酸序列同源性比較

2.6 分離株遺傳進化分析 利用 MEGA 6.0構建的系統發育進化樹如圖3所示,分離株CAU1501 與 A 亞群ALV參考株 SDAU09E2 (2009年山東分離株)的遺傳親緣性最近,與J亞群ALV參考株CAUHM01(2011年北京分離株)遺傳親緣性最遠。結合抗體檢測結果和gp85基因同源性分析結果,最終確定CAU1501為1株A亞群ALV。

圖3 分離株 CAU1501 與各亞群參考株gp85基因核苷酸序列的進化樹分析

3 討論

AL是由禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的,以造血細胞惡性增生為主的傳染性疾病,在全世界范圍內均有發生,是危害養禽業的主要疾病之一,感染ALV的禽類,一般不會表現出臨床癥狀,死亡率較低,因此,未能引起足夠的重視。直到20世紀末,J亞群ALV在世界范圍內的發生和暴發[18],給養禽業帶來了巨大的危害和經濟損失,AL才受到重視。1999 年,王輝等[13]從我國的山東省和江蘇省首次分離和鑒定出了 4 個 J 亞群ALV的中國毒株,證明了J亞群ALV 在我國的存在。2008年,王輝等[12,13]發現,J亞群ALV開始在我國蛋用型雞中引發骨髓樣細胞瘤的流行。由此可見,從 20 世紀末以來,我國已經有了很多關于AL的報道,但是,其報道的主體主要還是集中在家禽上,國內罕見鴿子感染ALV的報道。因此,對鴿群進行詳盡的 ALV 抽樣調查意義重大。本試驗于2021年3—12月期間每月從北京市沙河地區某市場抽樣,共采取54只疑似AL信鴿的靜脈血樣本,經p27抗原檢測發現,有1份鴿子樣本感染了ALV,陽性率為1.9%。抗原陽性結果說明此ALV毒株可以感染DF-1細胞,通過DF-1細胞產生p27抗原,即從鴿群分離得到的ALV是1株外源性ALV。外源性ALV能夠在鴿子體內產生感染性粒子,除垂直傳播外,還可水平傳播,通過消化道排毒,污染周圍環境,大大增加健康鴿群感染ALV的風險[14]。

后續抗體檢測試驗中,對照組10份 SPF 雞血清樣本 ALV-Ab 和 ALV-J 抗體檢測結果均為陰性,說明試驗所用 SPF 雞自身不帶有 ALV-Ab 和 ALV-J 抗體;而試驗組10份 SPF 雞血清樣本 ALV-J 抗體檢測均為陰性,ALV-Ab 抗體檢測有4份 SPF 雞血清樣本為陽性,陽性率為40%,說明分離株 CAU1501 能夠感染 SPF 雞,并且能夠使其產生 ALV-Ab 抗體。針對這一結果可說明以下問題:第一,分離株 CAU1501 能夠誘導雞產生針對CAU1501的 ALV-Ab 抗體,進一步證明了分離株CAU1501 是1株外源性的 A 亞群或 B 亞群 ALV。第二,分離株 CAU1501 既能夠感染鴿子又能夠感染雞,感染宿主范圍的擴展加大了該病毒的防控難度,提示在鴿生產或雞生產中應防范周邊其他禽類養殖場,做好AL的疫病防控工作。

ALV 外周被稱為囊膜蛋白的外周蛋白包裹,該蛋白由env基因所編碼產生。分離株 CAU1501env基因全長為1 821 bp,編碼 607 個氨基酸。這些氨基酸能夠形成囊膜蛋白前體,囊膜蛋白前體水解產生表面蛋白SU(gp85)和穿膜蛋白TM(gp37)2種糖蛋白[15-17]。根據 ALV 蛋白囊膜基因序列來確定 ALV 亞型是目前國內外學者普遍認可的方法[18-20]。在本試驗中,分離株 CAU1501gp85基因核苷酸序列與各亞群 ALV代表株gp85 核苷酸序列相比,與 A 亞群ALV參考株PDRC-3249同源性最高,達到了89.2%,高于其他亞群;gp85基因系統進化樹顯示,分離株 CAU1501與 A 亞群 ALV參考株SDAU09E2處于同一分支上,遺傳親緣性最近。因此,綜合分離株 CAU1501gp85基因核苷酸序列和抗體試驗結果,判定分離株 CAU1501 是1株 A 亞群ALV。

本試驗的抽樣調查結果證實了北京周邊鴿群中可能存在ALV感染。對養鴿業存在一定的威脅,提醒各位鴿養殖主務必做好相應的防患措施和鴿群凈化措施。其次,信鴿的生活習性與野生鳥類的生活習性極為相似,且由于ALV能夠通過直接或間接接觸的方式進行水平傳播,因此北京甚至河北的野生鳥類也可能存在ALV感染。野生鳥類的遷徙范圍極廣,因此極有必要對北京周邊的野生鳥類進行系統的流行病學調查,做好相應的防患和凈化措施,以避免由于野生鳥類的大量遷徙而對當地家禽養殖業帶來的巨大危害。由于鴿群中已經存在ALV感染,北京周邊的各養禽業主應盡量避免家禽與鴿子接觸,包括養殖場周圍信鴿的停落、信鴿的糞便等都應引起各養殖戶的重視,從而減少家禽感染ALV的概率,避免不必要的損失。