禽腦脊髓炎病毒Luminex xTAG檢測方法的建立

張孟迪, 朱海波, 朱余軍, 伍妙梨, 練月曉, 黃碧洪, 葛 葉, 叢 鋒

(1.廣東海洋大學濱海農業學院, 廣東 湛江 524088 ; 2. 上海蠻蠻生物科技有限公司, 上海 奉賢 200000 ;3. 廣東省實驗動物監測所 廣東省實驗動物重點實驗室, 廣東 廣州 510663)

禽腦脊髓炎(Avian encephalomyelitis,AE)是一種影響雛雞、野雞、鵪鶉和火雞的傳染性病毒性疾病[1]。AE的特征是雛雞表現為頭部和頸部的快速震顫和運動共濟失調;產蛋雞表現為一過性產蛋下降,不出現神經癥狀[2,3]。1932年,該病在美國由Jones首次報道[4],目前已波及世界大多數國家,1980年我國首次發現[5],隨后該病在黑龍江、江蘇、上海和福建等地均有報道,且疫情呈逐年上升趨勢,給養禽業尤其是種禽養殖業造成了較大的經濟損失[6,7]。

目前,國內外傳統的禽腦脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)的檢測方法包括病毒分離[8]、酶聯免疫吸附試驗[9]、熒光抗體技術[10]和常規反轉錄-聚合酶鏈式反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)[11]等,這些檢測技術存在費時費力、特異性差、容易被污染等缺點。因此,建立一種針對AEV的特異、敏感、可靠的檢測方法勢在必行。本試驗旨在建立一種檢測AEV的Luminex xTAG技術方法,為AEV的高效檢測和準確定量提供一種可靠的新方法。

1 材料與方法

1.1 疫苗和病毒 AEV滅活疫苗,購自青島易邦生物工程有限公司。傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)、禽傳染性貧血病病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)、馬立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)和禽傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的核酸均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 大腸桿菌DH5α、PrimeScriptTMOne step RT-PCR kit、克隆載體pMD19-T、凝膠回收試劑盒和Easy Dilution等,均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa公司);鏈霉親和素-R-藻紅蛋白(Streptavidin R-phycoerythrin,SA-PE),購自美國Thermo Fisher Scientific公司;熒光編碼微球MagPlex-TAG077和鞘液,均購自Luminex公司;質粒提取試劑盒,購自OMEGA公司。

1.3 主要儀器 核酸自動抽取儀,購自天根生化科技(北京)有限公司;Luminex 200儀器,購自Luminex公司;核酸擴增儀,購自BIO-RAD公司。

1.4 臨床樣本 共45份腦組織臨床樣本,其中6份由廣東省農業科學院動物衛生研究所的孫敏華惠贈,其他39份來源于2021年本實驗室收集到的廣東省各市的組織樣本;10份健康雞的腦組織樣品來源于廣東省清河養雞場,均由本實驗室-80 ℃保存。

1.5 方法

1.5.1 引物和探針的設計和合成 根據GenBank中AEV的VP1基因的保守序列設計了1對用于快速檢測AEV的Luminex xTAG引物,在上游引物的5′端通過Spacer18間隔添加Tag序列,下游引物的5′端標記生物素(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 AEV引物和Luminex xTAG標簽

1.5.2 病毒核酸的提取 取0.5 g從雞場采集的組織樣品于離心管中,加入500 μL滅菌PBS,放勻漿器上勻漿,離心,取上清;將AEV滅活疫苗和組織勻漿液上清按照核酸自動抽取儀說明書操作進行RNA提取。

1.5.3 質粒標準品的制備和鑒定 以提取的病毒RNA作為模板,進行RT-PCR擴增,將PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳、切膠回收。將膠回收產物與pMD-19T載體連接,轉化至DH5α感受態細胞,選取單克隆進行培養,菌液進行PCR鑒定,將鑒定為陽性的菌液進行質粒抽提,測序后用MEGA軟件比對驗證。用分光光度計測定質粒濃度和純度,根據公式(1)計算拷貝數。

拷貝數(copies/μL)=6.022×1023(copies/mol)×DNA濃度(g/μL)÷DNA堿基數(bp)÷660 daltons/bp

(1)

1.5.4 AEV Luminex xTAG檢測方法的建立 RT-PCR反應體系:模板1 μL(<500 ng),2× One Step Buffer 10 μL,上、下游引物各1 μL,一步法酶1 μL,補水至 20 μL。RT-PCR反應程序:50 ℃ 30 min,94 ℃ 15 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循環35次;72 ℃終延伸10 min。將77號熒光編碼微球、RT-PCR產物和SA-PE雜交,用1.1×Tm Hybrdization Buffer將2 500個/μL 77號熒光編碼微球稀釋至125個/μL;用1×Tm Hybrdization Buffer將濃度為1 mg/mL的SA-PE稀釋100倍。取20 μL 稀釋的77號熒光微球工作液、5 μL RT-PCR產物和75 μL稀釋的SA-PE工作液混勻,于PCR儀中37 ℃孵育30 min;將雜交后的反應液于 Luminex 200 儀器進行讀數。最低檢測閾值(Cutoff值)的確定:選取10份健康雞的腦組織樣品(每個樣品平行重復3次),分別讀取熒光中位數(Median fluorescence intensity,MFI)值,計算其平均值和標準差,即為Cutoff值[12]。結果判定:當檢測樣本的MFI值>Cutoff值時,結果判定為陽性;否則判定為陰性。

1.5.5 特異性試驗 利用已建立的Luminex xTAG檢測方法,使用AEV、IBDV、CIAV、NDV、AIV、ILTV、ALV、MDV和IBV核酸作為模板,進行Luminex xTAG方法的特異性試驗。

1.5.6 敏感性試驗 用稀釋液將濃度為2.5×1010copies/μL的質粒標準品進行10倍倍比稀釋,取濃度為1×107～1×101copies/μL的質粒作為標準模板,進行Luminex xTAG方法的靈敏度分析。

1.5.7 重復性試驗 取濃度為1×105和1×107copies/μL的質粒標準品,每個濃度同時設3個重復;應用Luminex xTAG方法在3個不同時間段對這2個濃度的質粒標準品進行檢測,計算批間和批內變異系數,評估Luminex xTAG方法的重復性。

1.5.8 臨床樣本的檢測 使用已建立的AEV Luminex xTAG檢測方法對45份臨床樣品進行檢測,同時用SYBR Green I 實時熒光定量RT-PCR檢測方法進行驗證[13]。

2 結果

2.1 質粒標準品的制備和鑒定 通過PCR對構建的質粒進行鑒定,結果顯示,可擴增出125 bp的目的條帶,與預期片段大小一致(圖1)。測序結果通過MEGA軟件比對,與預期結果一致。經測定,質粒濃度為105.34 ng/μL,計算得拷貝數為1.65×1010copies/μL。

圖1 質粒標準品的PCR鑒定

2.2 特異性試驗 本試驗通過檢測10份健康雞組織獲得的Cutoff值為200。采用已建立的Luminex xTAG方法對AEV、IBDV、CIAV、NDV、AIV、ILTV、ALV、MDV和IBV進行檢測,結果顯示,只有AEV檢測呈陽性,與IBDV、CIAV、NDV、AIV、ILTV、ALV、MDV和IBV無交叉反應(圖2),表明建立的Luminex xTAG方法特異性好。

圖2 Luminex xTAG方法的特異性試驗

2.3 敏感性試驗 取10倍倍比稀釋的濃度為1×107～1×101copies/μL的質粒標準品進行檢測,結果顯示,本試驗建立的Luminex xTAG檢測方法的靈敏度可達1×102copies/μL(圖3)。

圖3 Luminex xTAG 方法的敏感性試驗

2.4 重復性試驗 通過對濃度為1×105和1×107copies/μL 的質粒標準品進行批內和批間重復性試驗,經統計學分析,批內和批間的變異系數均小于4.0%(表2),表明建立的Luminex xTAG方法重復性和穩定性好,方法可靠。

表2 AEV Luminex xTAG方法的批內和批間重復性試驗

2.5 臨床樣本的檢測 應用已建立的 AEV Luminex xTAG檢測方法對45份臨床組織樣本進行檢測,共檢出陽性樣本6份,陽性率為13.33%(表3),同時使用SYBR Green I 實時熒光定量RT-PCR檢測方法進行驗證,2種檢測方法的檢測結果一致(表4)。

表3 AEV Luminex xTAG和SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR檢測方法對臨床樣本的檢測結果

表4 AEV Luminex xTAG與SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR檢測方法的對比

3 討論

AE是一種對雛雞、產蛋雞影響較大的急性、高度接觸性傳染病,不僅危害畜牧養禽業的發展,而且造成養殖戶的經濟損失。建立高敏感性和特異性的AEV診斷方法對有效預防AE具有重大意義。本試驗針對AEV的VP1基因的保守序列設計了1對特異性擴增引物,建立了AEV Luminex xTAG檢測方法。

Luminex xTAG技術是將帶有Luminex特定的anti-TAG標簽序列的磁性微球與待檢樣品的PCR產物混合,可在單一反應中檢測核酸[14,15]。微球在流動鞘液的帶動下依次通過紅綠激光,紅激光識別微球的熒光編碼,綠激光識別微球上報告分子的熒光強度,使用Luminex平臺軟件準確分析數據[16]。這項技術可用于人類臨床中呼吸道病原體和胃腸道病原體的診斷[17-19],然而該技術在獸醫研究中的應用卻很少。

本試驗建立的Luminex xTAG方法敏感性高,可達1×102copies/μL;特異性強,對IBDV、CIAV、NDV、AIV、ILTV、ALV、MDV和IBV的檢測結果均為陰性,無交叉反應;批內和批間重復性試驗的變異系數均在4.0%以下,具有可重復性。另外,該方法不需要進行電泳,避免了電泳操作過程中的污染。本試驗應用建立的Luminex xTAG檢測方法,對廣東省收集的45份雞組織樣本進行了檢測,6份樣品為陽性,為了進一步驗證該方法的檢測結果,同時使用SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR檢測方法對這批臨床樣品進行檢測,2種方法的檢測結果100%相符,表明本試驗建立的AEV的Luminex xTAG檢測方法具有靈敏度高、特異性好、穩定性好、可重復性的優點。AEV Luminex xTAG檢測方法的建立,可用于AEV的臨床診斷和流行病學調查,同時該方法靈活性好,可以在此基礎上加減需要檢測病原的種類,實現在同一樣本中的多種不同目的分子進行多重檢測[20]。本試驗建立的Luminex xTAG技術為AEV的檢測提供了一種新的選擇。