彎曲菌中氟苯尼考耐藥基因fexA功能鑒定及其攜帶質粒分析

陳 宇, 焦 典, 趙文博, 張 程, 姚 紅

(河南農業大學動物醫學院, 河南 鄭州 450046)

彎曲菌屬中的空腸彎曲菌和結腸彎曲菌是食源性人獸共患病原菌,可以通過食物鏈傳播給人類,導致人類的消化道疾病(如腹瀉)甚至神經性疾病(如格林-巴利綜合征)[1]。抗生素在醫學臨床和獸醫臨床的廣泛應用導致了耐藥彎曲菌的出現和傳播,耐藥彎曲菌一旦沿食物鏈傳播給人類,將會嚴重限制臨床治療用藥選擇,給公共衛生安全帶來巨大挑戰。

通過結構修飾的氟苯尼考在安全性和有效性方面顯著優于氯霉素和甲砜霉素,于20世紀90年代被投入市場使用[2]。該藥主要用于治療牛、豬、禽和水產養殖中的細菌性疾病,是治療動物性疾病最常用的抗生素之一。但隨著氟苯尼考在獸醫臨床中的大量使用,對氟苯尼考耐藥的彎曲菌日益增多[3]。目前,細菌對氟苯尼考的耐藥機制主要分為以下三類:(1)外排蛋白導致的主動外排,主要由fexA、fexB、floR和optrA基因介導[4-6];(2)RNA甲基轉移酶的修飾,主要由cfr基因介導[7];(3)核糖體保護,主要由poxtA基因介導[8]。自上述氟苯尼考耐藥基因在革蘭陽性菌中被發現以來,主要在革蘭陽性菌(葡萄球菌和腸球菌等)中被報道。然而,近年來,在彎曲菌中也報道了fexA、optrA和cfr(C)基因的存在[9-11]。

外排蛋白編碼基因fexA于2004年在1株緩慢葡萄球菌的質粒pSCFS2中被發現,該基因編碼475個氨基酸,包含14個跨膜區[4]。fexA基因編碼外排蛋白,屬E-4族成員,與其他氯霉素類藥物外排基因同源性較低。此外,在fexA基因上游存在類似衰減子的結構,可對fexA基因的誘導表達進行調節。基因功能研究證實,fexA基因可介導氯霉素和氟苯尼考耐藥[4]。對fexA基因環境研究發現,該基因定位于質粒的新型轉座子Tn558中,易通過轉座子和質粒在不同種屬細菌中進行傳播[12]。近年來,fexA基因在彎曲菌中也被相繼報道[9,13]。研究發現,fexA基因位于彎曲菌染色體,與四環素類耐藥基因tet(L)等形成耐藥基因島,插入至彎曲菌保守基因moeA2與cj1528之間[9]。

本課題組前期發現了1株攜帶fexA基因的豬源結腸彎曲菌,本試驗將針對該基因介導氟苯尼考耐藥表型的功能以及遺傳環境進行確證和分析,闡明fexA基因在彎曲菌中作用和遺傳特征,以期為合理用藥和氟苯尼考耐藥性防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 MH瓊脂(Mueller hinton agar,MHA)培養基,購自美國Sigma-Aldrich公司;SOC肉湯(SOC broth)培養基,購自青島捷世康生物科技有限公司;無菌脫纖維羊血,購自北京陸橋技術有限公司;PremixExTaq(Loading dye mix),購自寶生物工程(大連)有限公司;NEBuilder?HiFi DNA Assembly Master Mix,購自美國NEB公司;大腸桿菌感受態細胞DH5α和pUC-19載體,均購自北京莊盟國際生物基因有限公司;Wizard Genomic DNA Purification Kit,購自美國Promega公司;QIAGEN Plasmid Midi Kit,購自德國QIAGEN公司。

1.2 主要儀器 二氧化碳培養箱,日本三洋公司產品;PCR儀和電泳成套設備,美國 BIO-Rad公司產品;超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司產品;單道移液槍,德國 Eppendorf公司產品;電轉化儀,美國BTX公司產品。

1.3 菌株 結腸彎曲菌C19來源于養殖場生豬;空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)ATCC 33560和空腸彎曲菌NCTC 11168均為本實驗室保存菌株。

1.4 試驗方法

1.4.1 藥物敏感性試驗和氟苯尼考耐藥基因檢測 根據美國臨床實驗室標準委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) 推薦的瓊脂稀釋法測定彎曲菌對氟苯尼考的敏感性。藥敏試驗質控菌株為ATCC 33560,結果判定依據參照CLSI判定標準(https://www.clsi.org/standards/products/microbiology/companion/using-m100/)。根據參考文獻[9]中引物(Primer-L,5′-CCATTCCGACACCAACCT-3′;Primer-R,5′-CCATTCCGACACCAACCT-3′)和擴增條件,通過PCR方法對fexA基因進行檢測。此外,參照參考文獻[9]對氟苯尼考耐藥基因fexB、floR、optrA、cfr(C)和poxtA進行檢測。

1.4.2fexA單基因克隆構建 為了確證C19 對氟苯尼考的高水平耐藥表型是由fexA基因介導,通過構建cj0299-fexA-erm(B)-panB片段對fexA基因介導的氟苯尼考耐藥功能進行驗證,通過自然轉化方法將該片段導入至受體菌株NCTC 11168,測定最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。具體試驗方法:將cj0299、fexA、erm(B)和panB基因序列添加至軟件NEBuilder中,設計引物P1～P8,引物序列見表1。分別用P1、P2擴增cj0299基因;P3、P4擴增erm(B) 基因;P5、P6擴增fexA基因;P7、P8擴增panB基因。PCR 反應體系(50 μL):PremixExTaq25 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 21 μL。PCR反應程序:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性30 s,退火溫度分別為55 ℃(cj0029)、56 ℃[erm(B)]、55 ℃(fexA)和57 ℃(panB),退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃后延伸10 min。將PCR產物用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix進行連接,然后與pUC-19載體相連,轉化至感受態細胞DH5α,具體步驟參照說明書。以連接產物為供體,NCTC 11168為受體進行自然轉化,用濃度為4 μg/mL的紅霉素篩選轉化子,隨后用fexA基因檢測引物(引物序列見1.4.1)進行PCR擴增以對轉化子進行確證。對確證的轉化子進行藥物敏感性試驗,測定氟苯尼考對轉化子和受體菌株的MIC值。

表1 用于構建fexA單基因克隆的PCR擴增引物

表2 氟苯尼考對菌株的MIC值

1.4.3 全基因組測序和攜帶fexA基因環境分析 為分析fexA基因的遺傳環境,對菌株C19進行全基因組測序和分析。運用細菌基因組提取試劑盒Wizard Genomic DNA Purification Kit提取攜帶fexA基因菌株的全基因組,之后將提取的基因組送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行全基因組測序分析(Illumina HiSeq 2500 platform)。運用BioNumerics v. 8.0(Applied Maths)對測序獲得的基因組進行組裝,通過RAST(https://rast.nmpdr.org/rast.cgi)對開放閱讀框(Open reading frame,ORF)進行預測和分析,用Artmis軟件對fexA基因遺傳環境圖譜進行分析和繪制,運用BRIG軟件進行質粒比對分析。

1.4.4 電轉化試驗 按照QIAGEN Plasmid Midi Kit說明書操作提取質粒。將含有fexA基因的質粒電轉化至空腸彎曲菌NCTC 11168中。具體方法:將1 μg質粒DNA置于透析膜上30 min,然后添加至解凍的感受態細胞,混合均勻;將混合物加入電轉杯,在200 Ω、25 μFd和1.8 kV條件下進行電轉化;添加SOC肉湯300 μL,將菌液轉移至EP管,42 ℃微需氧條件培養1 h;將菌液涂布于含有8 μg/mL氟苯尼考的MH瓊脂平板,42 ℃微需氧條件培養48 h,篩選電轉子。

1.4.5 反向PCR 對環狀中間體進行檢測和驗證,用參考文獻[9]中報道的引物進行反向PCR(primer-L,5′-CCATTCCGACACCAACCT-3′;primer-R,5′-CCATTCCGACACCAACCT-3′)。PCR反應體系(50 μL):PremixExTaq25 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 21 μL,進行PCR擴增。PCR反應程序:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃后延伸10 min。

2 結果

2.1 藥物敏感性試驗和氟苯尼考耐藥基因檢測 在對彎曲菌(主要為空腸彎曲菌和結腸彎曲菌)耐藥監測過程中發現1株豬源結腸彎曲菌(命名為C19)對氟苯尼考呈現較高水平耐藥表型(MIC=64 μg/mL)。運用PCR方法對C19耐藥基因進行檢測,結果顯示,該菌株含有外排泵編碼基因fexA,而其他氟苯尼考耐藥基因,如fexB、floR、optrA、cfr(C)和poxtA在該菌株中未檢出。因此,推測菌株C19對氟苯尼考的高水平耐藥表型由fexA基因介導。

2.2fexA單基因克隆構建 構建的cj0299-fexA-erm(B)-panB片段含有NCTC 11168菌株保守基因panB和cj0299的同源序列,通過同源重組,fexA-erm(B)成功整合至panB和cj0299基因之間,得到轉化子11168-fexA。運用瓊脂稀釋法測定氟苯尼考對C19、NCTC 11168、11168-fexA和ATCC 33560菌株的MIC,結果顯示,轉化子11168-fexA對氟苯尼考呈現高水平耐藥表型,MIC值為32 μg/mL,比受體菌株NCTC 11168對氟苯尼考的MIC值提高了32倍。結果證實,fexA基因可介導彎曲菌對氟苯尼考的高水平耐藥。

2.3 全基因組測序和fexA基因環境分析 基因注釋分析結果顯示,fexA基因位于1個長度為13 793 bp的質粒上,將其命名為pC19-fexA,該質粒包含13個ORF,其中有7個假蛋白(Hypothesis protein,hp),不包含編碼接合轉移功能蛋白的相關基因。fexA上游為hp,下游是整合酶編碼基因(圖1)。值得注意的是,質粒pC19-fexA有2個與其復制相關的rep基因(圖1),而進一步分析表明,質粒復制子未有具體分型。

圖1 攜帶fexA質粒pC19-fexA圖譜和開放閱讀框標注

將質粒pC19-fexA序列進行基因組比對分析,結果顯示,質粒pC19-fexA與數據庫中質粒序列相比同源性介于96.15%～99.72%,而覆蓋度最高僅為74%。將質粒pC19-fexA與數據庫中質粒進行比對分析,發現與該質粒同源性最高(98.85%)且覆蓋度最高(74%)的質粒是來源于羅氏檸檬乳桿菌的質粒pAN417B(CP054659),值得注意的是,pAN417B也攜帶fexA基因(圖2)。此外,質粒pC19-fexA與其他質粒相比,雖然同源性較高(>99.00%),但是覆蓋度均較低,如序列號為CP065854和CP030091的質粒(圖2)。

圖2 pC19-fexA與數據庫參考質粒基因組比對

2.4 電轉化試驗和反向PCR 為檢測質粒pC19-fexA是否能夠發生轉移,進行了電轉化試驗。盡管多次嘗試,但并未獲得相應電轉子,表明攜帶fexA基因的質粒pC19-fexA不能通過電轉化發生水平傳播。通過反向PCR檢測是否能夠形成包含fexA基因的環狀中間體,結果顯示,未得到相應的擴增片段。此外,本試驗未能獲得相應的接合轉移子,與該質粒不包含接合轉移蛋白編碼基因的基因型一致。

綜上所述,本試驗結果表明,pC19-fexA質粒攜帶可介導氟苯尼考高水平耐藥的fexA基因;fexA和hp基因和整合酶編碼基因相鄰,不能形成環狀中間體;pC19-fexA質粒與其他質粒結構不同,且該質粒不能通過電轉化和接合轉移發生水平傳播。

3 討論

外排泵編碼基因fexA可介導葡萄球菌對酰胺醇類藥物的高水平耐藥[4]。本試驗構建fexA單基因克隆,通過自然轉化成功獲得了含有fexA基因的背景清晰的工程菌株轉化子11168-fexA,證實了該基因在彎曲菌種屬中介導氟苯尼考耐藥的功能。相較于以原代菌全基因組為供體基因組進行自然轉化的方法,單基因克隆更能明確地說明fexA基因介導氟苯尼考耐藥的功能。此外,本試驗以大環內酯類耐藥基因erm(B)作為篩選標記,防止其他酰胺醇類突變影響fexA基因功能的確證。因此,該基因功能確證方法易操作、結果可靠,可廣泛應用于其他基因的功能研究。

彎曲菌易吸收和整合外源基因至自身基因組,極大程度上豐富了彎曲菌基因組的多樣性。近年來,越來越多最初發現并流行于革蘭陽性菌中的耐藥基因在彎曲菌中被發現并報道,如大環內酯類耐藥基因erm(B)[14]、酰胺醇類耐藥基因optrA[10]、cfr(C)[11]和fexA[9],以及四環素類耐藥基因tet(L)[15]。上述耐藥基因整合至彎曲菌染色體基因組,可與其他耐藥基因形成多重耐藥基因島,通過同源重組在彎曲菌中發生水平傳播[15,16]。自fexA基因被發現以來,其在革蘭陽性菌中被報道較多,如葡萄球菌和腸球菌[12,17]。而近年來,fexA基因在彎曲菌中被發現并報道[9]。基因序列分析顯示,fexA基因多位于彎曲菌染色體上的多重耐藥基因島,僅有1株彎曲菌中fexA基因位于質粒,該質粒pCJFEX為48 003 bp,編碼58個ORF[18]。而本試驗結果顯示,fexA基因位于1個長度約為13 kb的具有新型結構的小質粒,與先前報道的質粒結構不同。實驗室條件下,該質粒雖然不能發生水平傳播,但是作為fexA基因載體的作用卻不容忽視。質粒pC19-fexA中包含的大部分ORF經比對注釋后均為假蛋白編碼基因hp,但是這些假蛋白在該質粒的生存、穩定性或者適應性中是否發揮作用,需要進一步進行功能研究。

已報道的fexA基因環境并不完全一致,但fexA基因周圍均存在插入序列。有研究表明,fexA基因位于結腸彎曲菌染色體,上下游被同向的IS1216E包圍(SAMN11316573)[9]。另有研究發現,位于質粒pCJFEX的fexA基因被插入序列IS1216包圍(CP048762),位于染色體的fexA基因環境與質粒pCJFEX上的類似,均為可移動遺傳元件[18]。fexA基因周圍的IS1216在整合攜帶fexA基因的片段中發揮了關鍵作用。而本試驗發現,fexA基因位于1個長度為13 793 bp的質粒pC19-fexA上,fexA上游為hp,下游為整合酶編碼基因,與之前報道的fexA基因環境不同。雖然反向PCR、電轉化和接合轉移試驗均證實fexA基因不能發生傳播,但本試驗發現的fexA基因新型攜帶載體說明fexA基因環境多樣。

本試驗針對fexA基因陽性菌株進行研究,確證了fexA基因在彎曲菌中介導氟苯尼考耐藥的功能。基于全基因組測序數據分析了fexA基因的新型遺傳環境,揭示了fexA基因載體的新形式,為控制fexA基因在彎曲菌中的傳播提供理論依據。