子宮內(nèi)膜異位癥纖維化小鼠模型的建立和表型驗證

吉秀家, 黃燦燦, 毛海燕,2, 岳 斌, 李新月, 張小花, 武權生

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院 甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室, 甘肅 蘭州 730000 ;2.甘肅省人民醫(yī)院, 甘肅 蘭州 730030)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EMs)是指子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)種植于子宮以外的一種慢性疾病,在育齡期女性中發(fā)病率達10%[1,2]。該病雖為良性病變,但由于其病變廣泛、形態(tài)多樣、極具侵襲性和復發(fā)性、且具有雌激素依賴性等特點,有“類癌”的稱號。目前,EMs發(fā)病機制和病理生理知之甚少,治療方面研究亦進展緩慢。據(jù)報道,超過50%的不孕癥和30%的慢性盆腔痛都是由EMs引起的[3],嚴重影響了女性的生活質(zhì)量,且對社會衛(wèi)生資源造成重大負擔[4]。

與在位子宮內(nèi)膜一樣,EMs異位病灶也會發(fā)生周期性的反復出血,反復的損傷和修復可引起盆腔粘連,最終導致纖維化[5,6]。纖維化被認為是EMs的眾多病理機制之一[7]。纖維化相關疾病發(fā)病機制具有共同特征,包括上皮-間質(zhì)細胞的相互作用(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)、炎癥反應和成纖維細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化(Fibroblast-myofibroblast transdifferentiation,FMT)[8]。盡管對這些機制已經(jīng)開展了很長時間的研究,但EMs纖維化的形成機制依舊不明確,探究其具體發(fā)病機制仍然是婦科生殖內(nèi)分泌學的挑戰(zhàn)之一。

對EMs發(fā)病機制的探索主要來源于動物實驗研究[9],目前,EMs造模的方法主要包括自體移植型、同種異體移植型和人子宮內(nèi)膜組織異種移植型,但均存在一定的弊端[10]。自體移植具備成本低、操作簡單、誘導病灶生長時間短等優(yōu)勢,是目前最為常用的方式之一,然而該方法建模中不能保留完整的子宮,使得模型應用受限,不適用于對生育能力等影響的研究;人子宮內(nèi)膜組織異種移植保留人源性組織形態(tài)和生化特性,但受體小鼠需為免疫缺陷小鼠,不適合長期研究[11]。本課題組長期從事EMs纖維化機制和中醫(yī)藥干預機制研究,多次嘗試應用不同造模方法(包括自體移植和異體移植)和不同種鼠(Wister大鼠、KM小鼠和BALB/c小鼠)構建EMs纖維化模型,結(jié)果顯示,采用同種異體移植法構建BALB/c小鼠EMs模型成模率最高,并可顯著提高纖維化相關蛋白的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只6～8周齡BALB/c雌性小鼠,體重18～20 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,生產(chǎn)許可證號[SCXK(京)2019—0010],飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級動物房,許可證號[SYXK(甘)2021—0004]。所有小鼠適應性飼養(yǎng)1周。試驗操作均嚴格遵照動物倫理相關規(guī)定執(zhí)行并通過甘肅中醫(yī)藥大學動物中心倫理委員會批準(編號:2020-299)。

1.2 主要試劑 苯甲酸β-雌二醇、實驗用玉米油、二甲亞砜和預染Marker,均購自上海麥克林生化科技股份有限公司;RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒,均購自北京索萊寶公司;轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-beta1,TGF-β1)、上皮細胞鈣粘蛋白(Calcium-dependent cell adhesion molecule,E-cadherin)、人膠原蛋白I(Human collagen I,Collagen I)、α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)、纖連蛋白(Fibronectin,FN)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體,均購自安諾倫(北京)生物科技有限公司。Masson三色染色液套裝(A液是2.5%重鉻酸鉀媒染劑,B液與C液等體積混合后為Weigert鐵蘇木素染液,D液是麗春紅酸性品紅,E液是1%磷鉬酸溶液,F液是2.5%苯胺藍溶液),購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 高速冷凍離心機,美國BECKMAN公司產(chǎn)品;熱板儀,成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品;Western blot轉(zhuǎn)膜儀、Western blot電泳儀和Western blot電源,均為自北京君意東方電泳設備有限公司產(chǎn)品;超低溫冰箱,中科美菱低溫科技公司產(chǎn)品;搖床,海門市麒麟醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品;酶標儀,美國賽默飛公司產(chǎn)品;恒溫水浴鍋,常州市江南儀器廠產(chǎn)品。

1.4 藥物配制 稱取1.5 mg苯甲酸β-雌二醇粉末,用5 mL二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和45 mL實驗用玉米油溶解,配成濃度為30 μg/mL的苯甲酸β-雌二醇溶液,置4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 模型建立 試驗共納入60只小鼠,適應性飼養(yǎng)1周后,采用隨機數(shù)字表法隨機分為3個組,其中36只用于模型組,24只作為對照組。36只模型組小鼠按照1∶2的比例隨機分為供體組12只和受體組24只。受體組小鼠分別在種植后7、14、21和28 d四個時間段處死,進行模型評價,每組取6只。具體模型構建方法:(1)造模前用藥:除對照組外,所有實驗小鼠頸背部皮下注射苯甲酸雌二醇溶液150 μg/(kg·bw),每4 d注射1次,共注射2次,目的是使所有小鼠處于同一動情周期[12]。(2)供體小鼠取材:頸椎脫臼法處死供體組小鼠后,打開腹腔迅速取出小鼠的子宮,放入預冷的生理鹽水中清洗血液和黏液,然后將子宮一分為二,分別放入盛有0.5 mL預冷的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline,PBS)的培養(yǎng)皿中,用眼科剪將子宮縱向剖開,迅速將其剪成體積≤1 mm3的內(nèi)膜碎片,制成懸浮液,用1 mL注射器吸入子宮內(nèi)膜混懸液備用(接20 mL注射器針頭)。(3)受體小鼠腹腔注射:腹部皮膚碘伏消毒后,一手固定小鼠并使其頭朝下,一手拿準備好的含供體小鼠子宮內(nèi)膜混懸液的注射器,以小鼠下腹部正中尿道口上方約0.5 cm處為進針點,注入受體小鼠腹腔,注射后針孔處稍按壓片刻,并涂抹紅霉素軟膏預防感染。每只供體小鼠子宮平均分給2只受體小鼠。造模過程中保持無菌,所有操作在5 min內(nèi)完成。對照組小鼠腹腔注入等量PBS溶液。(4)種植后處理:腹腔種植內(nèi)膜當日開始對受體小鼠頸背部皮下注射苯甲酸β-雌二醇溶液150 μg/(kg·bw),每4 d注射1次,共注射2次,之后待子宮內(nèi)膜自然生長。

1.6 樣本采集和處理 分別于造模后第7、14、21和28 d末取材,每次取材隨機選取模型組小鼠6只,對照組小鼠6只。采用頸椎脫臼法處死小鼠,用75%乙醇消毒小鼠腹部,逐層打開腹腔,對照組取出子宮,模型組觀察異位灶組織部位、形態(tài)、大小、體積及其與周圍組織的關系,盡可能剝離異位灶組織,將其分為兩部分,一部分放入4%多聚甲醛溶液中,室溫固定24 h后常規(guī)石蠟包埋,制作病理切片。另一部分置于凍存管中-80 ℃冰箱保存,用于蛋白表達檢測。

1.7 監(jiān)測指標

1.7.1 一般狀況觀察 觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、活動情況、毛發(fā)光澤度、進食、排便和有無死亡等一般情況。在模型誘導前(第0天)測量各組小鼠體重,模型誘導后不同時間段(7、14、21和28 d)測量各組小鼠體重,并記錄。

1.7.2 熱板試驗 在模型誘導前(第0天),使用熱板儀對小鼠進行熱板試驗[13],并記錄熱痛潛伏期。納入標準:10 s≤熱痛時間≤30 s,不符合者剔除。模型誘導后不同時間段(7、14、21和28 d)評估和記錄所有小鼠的熱痛潛伏期。

1.7.3 腹腔粘連評分 采用Blauer粘連評分系統(tǒng)對受體小鼠腹腔粘連程度進行評分[14]。具體標準:0分為無粘連;1分為盆腔輕微的膜狀粘連;2分為粘連致密,通常宮角與腸管和膀胱均有粘連;3分為粘連更致密,范圍更廣,雙側(cè)宮角均與腸管和膀胱粘連,子宮尚有一定活動度;4分為嚴重的粘連,雙側(cè)宮角均與腸管和膀胱粘連,子宮固定不動。粘連評分由2位工作人員獨立進行,最終取平均值。

1.7.4 異位灶體積測量 剝離異位灶后,用游標卡尺測量其長、寬和高,按公式(1)計算異位灶體積(V)[15]。

V=π÷6×長×寬×高

(1)

式中,π為圓周率=3.14。

1.7.5 H.E.和Masson染色 取經(jīng)4%多聚甲醛固定的同一部位的異位灶組織,石蠟包埋切片,經(jīng)二甲苯脫蠟3次,用過乙醇水清洗后,蘇木精染色,水洗干凈。經(jīng)H.E.和Masson染色,中性樹膠封片,光學顯微鏡觀察。通過H.E.染色觀察異位灶形態(tài);Masson染色評價異位病變中的膠原沉積的程度,其中,肌纖維呈紅色,膠原纖維呈藍色,細胞核呈黑褐色,利用Image J對藍色染色的膠原纖維層的面積進行半定量分析。

1.7.6 Western blot檢測蛋白表達 取異位灶組織,用4 ℃預冷的生理鹽水溶液洗滌后切碎,加入適當比例的RIPA裂解液進行裂解,均質(zhì)化后離心取上清液,按BCA蛋白測定試劑盒說明書操作測定總蛋白濃度,用Western blot檢測TGF-β1、E-cadherin、Collagen I、α-SMA和FN蛋白的表達,以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察 整個試驗過程中,無小鼠死亡。對照組小鼠一般狀態(tài)良好。模型組小鼠造模后飲食量減少,活動減少,7 d后逐漸緩解,表現(xiàn)為喜扎堆、易激惹等。

2.2 體重和熱板試驗 結(jié)果如圖1所示,造模前各組小鼠的體重和熱痛潛伏期經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。EMs造模后,對照組小鼠體重穩(wěn)步增長,模型組小鼠體重呈先下降后增加趨勢,與對照組相比,模型組小鼠的體重在造模后21和28 d差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)。模型組小鼠熱痛潛伏期在造模后開始逐漸縮短,隨時間延長熱痛潛伏期縮短逐漸加重,與對照組比,模型組小鼠熱痛潛伏期在造模后14、21和28 d的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001);模型組小鼠與造模后7 d比,14、21和28 d差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 不同時間段兩組小鼠的體重(A)和熱痛潛伏期(B)比較

2.3 腹腔粘連評分和異位灶體積 結(jié)果如圖2所示,隨著造模時間的延長,對照組各時間段腹腔粘連評分比較無統(tǒng)計學意義;模型組小鼠腹腔粘連程度逐漸加重,與造模后7 d比,14 d小鼠腹腔粘連評分差異不顯著(P>0.05),21和28 d小鼠腹腔粘連評分極顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。隨著造模時間的延長,模型組小鼠腹腔異位灶數(shù)量無明顯變化,但體積呈先增大后縮小再增大的趨勢,與造模后7 d比,14 d異位灶體積顯著縮小,差異具有顯著性(P<0.01),造模后21 d,差異不具有顯著性(P>0.05),造模后28 d體積再次增大,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 模型組小鼠腹腔粘連評分(A)和異位灶體積(B)

2.4 異位灶形態(tài)學觀察 造模后7、14、21和28 d均可在模型組小鼠腹腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)異位灶結(jié)節(jié),造模成功率為100%。其中腹壁最多見,其次為腸系膜、肝下和卵巢,且異位灶結(jié)節(jié)與周圍組織有不同程度的粘連。異位灶為囊性不規(guī)則形態(tài),大部分呈半透明色,囊內(nèi)含淡黃色或半透明液體,囊壁表面有細小血管形成,邊緣含有結(jié)締組織(圖3)。H.E.染色結(jié)果顯示,對照組子宮黏膜上皮結(jié)構完整,上皮細胞形態(tài)結(jié)構正常,大小一致,排列整齊,固有層子宮腺體數(shù)量豐富,間質(zhì)較致密,未見明顯炎性細胞浸潤;模型組異位灶在造模后7 d即可見上皮和間質(zhì)細胞,由內(nèi)向外依次可見上皮細胞、間質(zhì)和肌層組織,層次較清,子宮內(nèi)膜樣腺體數(shù)量減少(圖4)。結(jié)果表明,EMs模型建立成功。

圖4 對照組(A)和模型組(B)小鼠子宮異位灶病理學檢測(H.E.染色,200×)

2.5 異位灶纖維化評價 對照組子宮有少量膠原沉積,模型組異位灶膠原沉積明顯,主要分布在間質(zhì)和肌層,隨著造模時間的延長,病灶膠原沉積顯著增加(圖5)。對膠原沉積面積進行半定量分析,結(jié)果顯示,隨著造模時間的延長,膠原纖維沉積逐漸增多,與造模后7 d比,14 d差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),21和28 d膠原沉積差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.001)(圖6)。

圖6 模型組小鼠異位灶膠原沉積面積

2.6 纖維化相關蛋白表達檢測 Western blot蛋白檢測結(jié)果如圖7所示,纖維化相關蛋白Collagen I、E-cadherin、FN、TGF-β1和α-SMA在異位灶中均有表達,與對照組相比,造模后7 d時α-SMA表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),Collagen I、E-cadherin、FN、TGF-β1表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨造模時間延長,E-cadherin表達量呈逐漸降低趨勢,與造模后7 d比,14、21和28 d差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。隨造模時間延長,FN和TGF-β1表達量有遞增趨勢,與造模后7 d比,僅28 d差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.001)。隨造模時間延長,α-SMA和Collagen I表達量遞增,與造模后7 d比,14、21和28 d差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。

圖7 Western blot檢測纖維化相關蛋白的表達

3 討論

EMs是有活性的內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔以外的部位,并伴隨月經(jīng)周期出現(xiàn)周期性的出血為特征的疾病。異位的子宮內(nèi)膜可侵犯全身任何部位,嚴重危害女性的身心健康。目前研究認為,炎癥反應和纖維化參與了EMs的發(fā)病進程[16]。病理學研究顯示,異位灶中除可見的內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細胞外,主要由大量的纖維化組織構成[17],但具體機制仍然不明確。為進一步探究EMs的發(fā)病機理,需要大量的臨床病例進行觀察研究,但大多數(shù)EMs很難在發(fā)病早期被診斷出來,而且在沒有充分、明確和安全的體內(nèi)外試驗研究結(jié)果的支撐下,使用新的藥理學和非藥理學療法直接干預人群顯然不符合倫理。

因此,構建良好的動物模型是研究EMs發(fā)病機制、發(fā)展動態(tài)變化和臨床治療策略的理想工具。目前,EMs造模可選用動物包括靈長類和嚙齒類動物。狒狒屬于靈長類動物,其與人類生殖系統(tǒng)構成、生理學和病理學有許多相似之處,能自發(fā)形成EMs,是最理想的研究EMs動物。但由于其價格昂貴、稀有、造模周期長等問題,難以展開研究。嚙齒類動物具有繁殖快、動情周期短而規(guī)律、成模率高等優(yōu)點,因此被廣泛應用于EMs模型構建,尤其是鼠類最常用。常用EMs模型構建方法包括同種移植和異種移植,同種移植又包括自體移植和同種異體移植。自體移植常選用縫合法,此方法操作相對復雜,創(chuàng)傷性較大,術后易發(fā)生粘連,且不能避免手術因素對疾病模型的影響。異種移植常選用人子宮內(nèi)膜種植的方法,雖然更符合人類的組織形態(tài)和各類生化指標變化趨勢,減少了物種差異性,但存在異體排斥反應,模型鼠死亡率較高。為避免排斥反應,常選用裸鼠和重度聯(lián)合免疫缺陷(Server combined immune-deficiency,SCID)等免疫缺陷小鼠,但不能模擬正常免疫狀態(tài)下的疾病情況[18],使該造模方式的使用受到限制。

本試驗所采用的BALB/c小鼠屬于近交系種鼠,個體間差異性小、基因高度純和、幾乎無異體排斥反應,多用于腫瘤學和免疫學等的研究。本試驗選用造模方法具有幾下特點:造模前,采用皮下注射雌激素的方法使小鼠的動情周期同步化,之后在動情前期將供體小鼠子宮碎片注射到受體小鼠腹腔,并給予雌激素皮下注射,使異位內(nèi)膜在小鼠體內(nèi)自然生長,且皮下注射雌激素,相比較于灌胃法減少了對小鼠的刺激,死亡率更低。該造模方法潛在的優(yōu)勢:(1)腹腔注射子宮碎片更類似于EMs經(jīng)血逆流的發(fā)病途徑;(2)供體或受體動物在造模前和造模后給予雌激素皮下注射,能更好地模擬EMs雌激素依賴的發(fā)病特征;(3)供體或受體動物可以在誘導之前進行干預,而后進行治療性研究[19,20];(4)避免了手術開腹對模型的影響,最大程度地降低了手術縫合造成小鼠盆腔纖維化的可能性,為探索正常免疫狀態(tài)下EMs纖維化的發(fā)病機制提供了保障。

EMs病變部位炎癥反應和纖維化的形成造成不同程度的盆腔粘連,而盆腔粘連可能是導致EMs患者臨床癥狀,如痛經(jīng)、深性交痛、慢性盆腔疼痛的主要原因,因此評價盆腔粘連程度具有重要意義。本試驗通過智能熱板儀評估不同時間段小鼠的熱痛潛伏期,作為疼痛的評價措施。結(jié)果顯示,模型組小鼠熱痛潛伏期隨造模時間延長呈現(xiàn)縮短趨勢,14 d開始潛伏期顯著縮短。通過公認的Blauer粘連評分系統(tǒng)對小鼠進行腹腔粘連評分,結(jié)果顯示,EMs模型小鼠腹腔粘連程度在造模14 d后逐漸加重。造模第7天即發(fā)現(xiàn)明顯異位灶,第14天異位灶的數(shù)量無顯著性變化,但體積有縮小,其原因可能是小鼠腹腔注射異位內(nèi)膜后激活了體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機制,短時間內(nèi)抑制了異位內(nèi)膜的生長。第21和28天體積再次增大,可能是異位內(nèi)膜在多種細胞因子和免疫細胞交互調(diào)節(jié)后繼續(xù)侵襲和生長的結(jié)果。Masson染色反映組織中膠原纖維的沉積情況[21,22],結(jié)果表明,EMs模型小鼠不同時間段異位灶均有膠原纖維沉積,隨時間推移膠原沉積有逐漸增多趨勢,以21和28 d最明顯。以上結(jié)果證實EMs模型構建成功,且異位灶存在纖維化。同時說明造模后14 d已形成較成熟的EMs異位灶。因此,造模后14 d可作為進一步藥物干預治療EMs的參考時間段。

細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的過度沉積是纖維化相關疾病的共同特征。TGF-β是一種具有多種生理功能的細胞因子[23],既往研究表明,TGF-β水平升高與許多纖維化疾病有關[24]。TGF-β1不僅能通過多路徑促進ECM成分的分泌,而且能誘導成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞,肌成纖維細胞又分泌額外的ECM成分和TGF-β1,并促進組織纖維化的形成[25]。α-SMA的高表達和ECM的異常沉積被認為是肌成纖維細胞的特有標志[26]。本試驗選取與纖維化密切相關的ECM成分作為纖維化主要評價指標。結(jié)果顯示,EMs模型小鼠異位灶中TGF-β1表達量水平隨模型時間延長而逐漸升高,說明TGF-β1升高可作為EMs纖維化的評價指標之一。上皮細胞標志物E-cadherin的表達隨時間延長明顯減弱,Collagen I(ECM主要成分)、α-SMA(肌成纖維細胞標志)和FN(ECM主要成分)表達量隨造模時間的延長,有逐漸增強的趨勢,以造模后28 d的表達量最顯著。這種變化趨勢符合纖維化疾病的發(fā)病機制,且與既往相關研究結(jié)果相一致[27,28]。故上述纖維化相關蛋白可用于EMs纖維化實驗研究的評價指標。

綜上所述,本試驗選用的異體移植法構建EMs小鼠模型的方法具有簡單、經(jīng)濟、成模率高的特點,重要的是避免了手術創(chuàng)傷導致的局部感染對結(jié)果可能造成干擾的問題,且符合EMs纖維化的發(fā)病特點。異體移植法可為EMs動物模型構建提供參考。然而,本試驗構建的模型可能不是最優(yōu)的,需要在后期試驗中不斷探索。另外,由于生理上的巨大差異,小鼠甚至狒狒的模型可能并不能概括人類疾病的所有特征。